何 嬌，羅陸僑，廖集琴

原位雜交和免疫組化雙染技術(shù)是在不同層次來檢測同一細胞上某些物質(zhì)的表達是否有相關(guān)性的一種實驗方法。由于操作步驟復(fù)雜，實驗不易取得理想效果。我科結(jié)合本實驗室實際情況，經(jīng)過反復(fù)摸索，獲得滿意效果，現(xiàn)將我科經(jīng)驗總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源收集廣東省人民醫(yī)院病理科2019年1～5月EBER陽性病例16例，其中NK/T淋巴瘤 8例，Burkitt淋巴瘤2例，血管免疫母細胞性淋巴瘤4例，漿母細胞性淋巴瘤1例，淋巴結(jié)外周T細胞淋巴瘤1例。所有標本均及時固定及規(guī)范化取材，經(jīng)10%中性福爾馬林固定。

1.2 試劑EBER原位雜交試劑盒購自北京中杉金橋公司，AP免疫組化試劑盒購自徠卡公司，CD3、CD20一抗購自上?；蚬尽?/p>

1.3 方法

1.3.1預(yù)實驗1 將組織連續(xù)4 μm厚切片4張，65 ℃烤片1 h，根據(jù)酶消化時間不同分為4個實驗組(表1)，先進行EBER原位雜交單染。

表1 預(yù)實驗1方法及結(jié)果

1.3.2預(yù)實驗2 根據(jù)預(yù)實驗1結(jié)果，選取胃酶消化12 min和16 min，再將實驗分為8組(表2)，進行第二步免疫組化染色。

表2 預(yù)實驗2方法及結(jié)果

1.3.3原位雜交和免疫組化雙染 根據(jù)預(yù)實驗1和預(yù)實驗2的染色結(jié)果，實驗條件有所改進：(1)切片脫蠟，無水乙醇洗3次，每次4 min，空氣中干燥切片。(2)滴加胃酶消化12 min，95%乙醇洗4 min，無水乙醇洗4 min，空氣中干燥切片。(3)滴加EBER探針，加蓋玻片，置于37 °C恒溫水浴箱中孵育3 h，揭開蓋玻片，PBS洗2次，每次4 min。(4)滴加地高辛二抗，室溫孵育30 min，PBS洗2次，每次4 min，DAB顯色5 min，PBS洗3 min。(5)免疫組化檢測在Leica Bond Ⅲ全自動免疫組化儀上進行，ER2修復(fù)12 min，PBS洗5 min×2。(6)一抗孵育55 min，PBS洗5 min×2。(7)Post primary AP孵育15 min，PBS洗5 min×2,Primary AP孵育15 min，PBS洗5 min×2。(8)快紅顯色10 min，蘇木精復(fù)染，干燥切片，中性樹膠封固。

1.4 判讀方法EBER原位雜交陽性為細胞核呈棕色，免疫組化陽性為胞膜呈紅色，雙染陽性者為同一細胞中細胞核呈棕色，細胞膜呈紅色。

2 結(jié)果

組織結(jié)構(gòu)完整，EBER原位雜交陽性為細胞核呈棕色，免疫組化陽性為胞膜呈紅色，每個切片中均可見雙染陽性細胞，染色效果滿意(圖1、2)。

①②

3 討論

EBV屬于皰疹病毒，是傳染性單核細胞增多癥的原因，也與自身免疫病和多種腫瘤相關(guān)，如Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌、毛細胞白血病和原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤[1]。在淋巴組織中，EBV可感染B、T及NK細胞，與其多種疾病有關(guān)[2]。EBV原位雜交法是檢測病理組織或細胞涂片中EBV病毒的常用檢測方法。原位雜交檢測EBER能夠定位EBV感染的細胞類型，是明確腫瘤與EBV相關(guān)的金標準[3]。但有時在淋巴瘤病理診斷中，單純性原位雜交和單純性免疫組化的基礎(chǔ)上難以精準判讀EBV陽性細胞的種系，給診斷帶來一定的困難。此時應(yīng)用雙染技術(shù)，可以在同一張切片上清晰地觀察到EBV陽性細胞是T淋巴細胞還是B淋巴細胞，有利于組織學判讀，從而更加容易做出明確診斷[4]。

酶消化是原位雜交檢測成功與否的關(guān)鍵步驟。其目的是去除靶核酸周圍的蛋白質(zhì)，增加組織的通透性，暴露靶基因，有利于探針滲透，增強雜交信號強度[5]。在單純性的EBER原位雜交檢測中，試劑盒推薦的酶消化時間為30 min，但作者發(fā)現(xiàn)，在EBER原位雜交和免疫組化雙染實驗中，如果先消化30 min后免疫組化再稍加修復(fù)，免疫組化染色大部分沒信號或信號極弱，細胞結(jié)構(gòu)往往不完整，呈修復(fù)過度狀態(tài)；如果免疫組化不修復(fù)，細胞結(jié)構(gòu)比較完好，但免疫組化染色太弱或沒信號，達不到染色要求。經(jīng)過反復(fù)摸索，作者首先就不同的酶消化時間對EBER原位雜交結(jié)果的影響進行比較，發(fā)現(xiàn)酶消化12、16、20 min，EBER原位雜交染色信號均夠強，背景干凈，達到染色要求。

在預(yù)實驗2中，雙染中的免疫組化在全自動免疫組化儀上完成，操作簡單，縮短了檢測時間。由于第一步原位雜交中組織已經(jīng)過一次預(yù)處理，相比免疫組化單染，雙染中的免疫組化只能采用較短的修復(fù)時間，才能既保證細胞結(jié)構(gòu)完好，又能取得滿意的免疫組化染色結(jié)果。

檢測中還需注意以下幾點：(1)切片脫蠟后，經(jīng)無水乙醇洗去二甲苯即可，無需經(jīng)低濃度乙醇，酶消化前需干燥切片，防止有水稀釋酶的濃度。(2)EBER探針可在37 ℃水浴箱孵育3 h或在室溫孵育過夜，可以取得相同的效果。在實際工作中可以根據(jù)實際情況選擇時間。(3)相比免疫組化單染，免疫組化雙染檢測中一抗的濃度需要更高，孵育時間更長，以增加抗原抗體的結(jié)合。(4)中性樹膠中含有二甲苯會導致紅色顯色劑褪色，封片后應(yīng)盡早采圖，防止顯色時間過長而褪色。