洪 楊，胡 沁，李曉靜，馬恩蘭，郭欣欣，侯英勇，宿杰·阿克蘇

子宮頸癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，其病死率較高[1-2]，流行病學(xué)研究顯示人乳頭瘤病毒(human papilloma virus, HPV)存在于99%的子宮頸癌中[3]，子宮頸癌的發(fā)病時(shí)間較長(zhǎng)，從癌前病變開(kāi)始可達(dá)10～30年[4]。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是預(yù)防子宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的重要手段。市場(chǎng)上HPV的檢測(cè)方法原理及特點(diǎn)均有所不同，其中獲得美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的方法僅有4種：Digene HC2 HPV HR test、Cervista HPV HR test、Cobas 4800 HPV test、Aptima HPV[5]。由于其檢測(cè)HPV操作步驟多而繁瑣、檢測(cè)成本高、不能具體分型每一種感染HPV型別等缺點(diǎn)，限制了其在臨床常規(guī)檢測(cè)中的廣泛應(yīng)用。不同HPV高危亞型在各類人群中的致癌能力是否不同，使HPV分型檢測(cè)得到越來(lái)越多關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)比較的qRT-PCR法、反向斑點(diǎn)雜交法和流式熒光法均經(jīng)FDA批準(zhǔn)，是國(guó)內(nèi)現(xiàn)有較常見(jiàn)的HPV分型檢測(cè)平臺(tái)，通過(guò)比較不同HPV檢測(cè)平臺(tái)特點(diǎn)及結(jié)果的差異性，為臨床選擇HPV檢測(cè)方法提供參考依據(jù)。

1.1 材料收集2018年5月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院行HPV檢測(cè)的800例子宮頸細(xì)胞標(biāo)本，年齡20～68歲，使用無(wú)菌細(xì)胞學(xué)采樣刷，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)3～5周刷取子宮頸鱗柱交界處脫落細(xì)胞，將收集的細(xì)胞保存于ThinPrep細(xì)胞保存液(HOLOGIC，美國(guó))中。

1.2 HPV檢測(cè)將所有送檢標(biāo)本先留取4 mL用于不同平臺(tái)HPV對(duì)比實(shí)驗(yàn)，其余標(biāo)本進(jìn)行液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)。

1.2.1qRT-PCR 留取的4 mL樣本中的1 mL均先用qRT-PCR試劑盒(上海之江生物公司)對(duì)15種高危型HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82)進(jìn)行分型檢測(cè)，操作方法嚴(yán)格按說(shuō)明書進(jìn)行，結(jié)果判斷：以循環(huán)閾值(Ct值)來(lái)標(biāo)記病毒負(fù)荷量，Ct值按如下公式計(jì)算，Ct=Ct標(biāo)本-Ct內(nèi)參照+28，其中內(nèi)參照為人單拷貝基因MNBH；若Ct≤38.0且擴(kuò)增曲線呈典型的S型，則判定為HPV陽(yáng)性。所有的陽(yáng)性病例(68例)和簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣法抽取的陰性病例(22例)再用流式熒光法分型檢測(cè)試劑盒(上海透景公司)和反向斑點(diǎn)雜交法分型檢測(cè)試劑盒(北京博暉公司)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2反向斑點(diǎn)雜交法 留取的4 mL樣本中的1 mL對(duì)18種高危型HPV(前15種加53、73、83)和6種低危型HPV(6、11、42、43、44、81)進(jìn)行分型檢測(cè)，操作方法嚴(yán)格按說(shuō)明書進(jìn)行，結(jié)果判斷：雜交膜的SP點(diǎn)(3個(gè))均有陽(yáng)性斑點(diǎn)，內(nèi)參質(zhì)控點(diǎn)(3個(gè))有陽(yáng)性斑點(diǎn)，且有HPV探針陽(yáng)性斑點(diǎn)出現(xiàn)，提示樣本為該探針對(duì)應(yīng)亞型陽(yáng)性。

1.2.3流式熒光法 留取的4 mL樣本中的1 mL對(duì)17種高危型HPV(前15種加53、26)和10種低危型(前6種加40、83、55、61)進(jìn)行分型檢測(cè)，操作方法嚴(yán)格按說(shuō)明書進(jìn)行，結(jié)果判斷：陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照Globin的信號(hào)﹥150，任何HPV型別特異性探針的信號(hào)﹥150則判定該探針對(duì)應(yīng)的型別為陽(yáng)性。

1.3 HPV基因測(cè)序三種HPV檢測(cè)平臺(tái)結(jié)果不一致時(shí)，則對(duì)樣本進(jìn)行HPV DNA的一代測(cè)序。樣本來(lái)源于留取的4 mL樣本中的1 mL。測(cè)序工作委托上海之江生物公司采用3730XL測(cè)序儀(ABI，美國(guó))進(jìn)行。

1.4 液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)所有病例均進(jìn)行液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，本實(shí)驗(yàn)獲得的液基細(xì)胞學(xué)結(jié)果報(bào)告采用TBS分級(jí)報(bào)告系統(tǒng)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算每種HPV型別檢測(cè)結(jié)果的Kappa指數(shù)(Kappa index, KI)，KI≥0.75定義為一致性極好，0.4

2 結(jié)果

2.1 不同HPV型別感染率的比較以一代測(cè)序結(jié)果為參照，統(tǒng)計(jì)標(biāo)本15種高危型HPV的感染率，感染率為7.125%(57/800)，感染率型別前三的分別為HPV 52、16、58型(圖1)。

圖1 高危型HPV陽(yáng)性標(biāo)本型別及對(duì)應(yīng)感染率

2.2 每種型別HPV檢測(cè)結(jié)果的一致性比較qRT-PCR與反向斑點(diǎn)雜交法結(jié)果一致性良好及以上為100%；qRT-PCR與流式熒光法結(jié)果一致性良好及以上為86.7%；流式熒光法與反向斑點(diǎn)雜交法結(jié)果一致性良好及以上為80%(表1)。

表1 三種平臺(tái)兩兩比較15種高危型HPV檢測(cè)結(jié)果一致性KI值

2.3 三種平臺(tái)HPV檢測(cè)結(jié)果與一代測(cè)序結(jié)果符合率比較由于有10例Ct值>36的樣本測(cè)序失敗，以一代測(cè)序結(jié)果作為參照，比較其余80例三種平臺(tái)檢測(cè)結(jié)果的符合率(表2)。qRT-PCR、反向斑點(diǎn)雜交法、流式熒光法的符合率分別為87.78%、94.45%、74.44%。qRT-PCR與反向斑點(diǎn)雜交法結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，流式熒光法與qRT-PCR、反向斑點(diǎn)雜交法結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明：反向斑點(diǎn)雜交法和qRT-PCR法與一代測(cè)序結(jié)果符合率較高，qRT-PCR和反向斑點(diǎn)雜交法的靈敏度分別為96.6%和91.6%。

表2 三種平臺(tái)兩兩比較15種高危型HPV檢測(cè)結(jié)果符合率

3 討論

本文通過(guò)對(duì)15種高危型HPV感染率的統(tǒng)計(jì)得出，感染率前三位的分別是HPV 52、16、58型，與文獻(xiàn)報(bào)道[6]的結(jié)果基本一致。高危型HPV分型檢測(cè)在子宮頸癌及其癌前病變的篩查中具有指導(dǎo)意義[7]。本組通過(guò)對(duì)不同的HPV檢測(cè)平臺(tái)所得檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較與分析，為探究最為準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)方法提供了依據(jù)，結(jié)果顯示：(1)qRT-PCR法和反向斑點(diǎn)雜交法的結(jié)果一致性最高，這與文獻(xiàn)[8-9]報(bào)道一致；(2)qRT-PCR法的靈敏性最高，反向斑點(diǎn)雜交法與一代測(cè)序結(jié)果符合率最高。這可能由以下兩方面原因所致：(1)一代測(cè)序的敏感度適中，低濃度的病毒載量無(wú)法檢出；(2)qRT-PCR法具有極高的靈敏性使得含量極低的靶基因亦可被檢測(cè)，而反向斑點(diǎn)雜交法敏感度適中，且一體成型不易交叉污染。比較三種平臺(tái)檢測(cè)特點(diǎn)，qRT-PCR法具有靈敏性高，操作簡(jiǎn)單，用時(shí)較短的特點(diǎn)，可對(duì)病毒負(fù)載量進(jìn)行檢測(cè)，但受熒光通道的限制只能檢測(cè)15種高危型HPV。反向斑點(diǎn)雜交法具有操作簡(jiǎn)單，特異性高，且實(shí)驗(yàn)環(huán)境不受PCR實(shí)驗(yàn)室分區(qū)限制的優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)結(jié)果定性不能定量。流式熒光法檢測(cè)的原理是利用微球-探針-PCR產(chǎn)物-生物素-鏈霉親和素-藻紅蛋白復(fù)合物的緊密結(jié)合，其檢測(cè)的HPV型別種類最多，通量大，但同時(shí)操作步驟多，易引入人為誤差，檢測(cè)結(jié)果定性不能定量，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其檢測(cè)結(jié)果和一代測(cè)序符合率僅74.44%，與qRT-PCR、反向斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)結(jié)果的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，原因可能因影響結(jié)合率的因素較多，使得無(wú)法保證百分之百的結(jié)合而影響檢測(cè)結(jié)果。三種檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)原理、引物、酶均不同，其檢測(cè)HPV基因型別有所不同，不同的引物探針對(duì)之間可能存在相互干擾，造成檢測(cè)結(jié)果存在一定的差異。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)10例qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果Ct值﹥36，而另兩種檢測(cè)平臺(tái)和一代測(cè)序均未測(cè)出，而液基細(xì)胞學(xué)結(jié)果均為輕～中度炎癥，說(shuō)明HPV敏感性過(guò)高可能并不具有很高的特異性，因此子宮頸癌的篩查方法并不推薦最敏感的方法。已有研究顯示僅有單獨(dú)HPV檢測(cè)的篩查增加了陽(yáng)性結(jié)果和陰道鏡檢查的數(shù)量，而長(zhǎng)期預(yù)后尚不確定[10]。研究表明，液基細(xì)胞學(xué)聯(lián)合高危型HPV檢測(cè)可顯著提高子宮頸癌病變的陽(yáng)性檢出率及特異性，減少過(guò)度治療的可能性[11]。本課題中組織學(xué)檢測(cè)病例樣本量相對(duì)較少，但入選病例為800例，樣本量相對(duì)較大，且三個(gè)不同平臺(tái)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果互相驗(yàn)證，所得結(jié)論與文獻(xiàn)報(bào)道一致，進(jìn)一步證明結(jié)果的準(zhǔn)確性。

綜上所述，qRT-PCR法和反向斑點(diǎn)雜交法的結(jié)果一致性最高，在臨床應(yīng)用上各有優(yōu)缺點(diǎn)，液基細(xì)胞學(xué)聯(lián)合高危型HPV檢測(cè)可顯著提高子宮頸癌病變的陽(yáng)性檢出率及特異性。今后的工作中可以結(jié)合病理組織活檢結(jié)果，擴(kuò)大研究規(guī)模，并開(kāi)展具有長(zhǎng)期隨訪結(jié)果的前瞻性研究。