張亞麗，李絲冰，王 藝，張 賀，張其棟，夏慶欣

甲狀腺癌(thyroid carcinoma, TC)發(fā)病率在全球呈逐年上升趨勢[1]。Haugen等[2]報道TC發(fā)病率雖然較高，但患者臨床預(yù)后普遍較好。影響TC患者預(yù)后的因素很多，如轉(zhuǎn)移(淋巴結(jié)或遠隔臟器)、基因突變及缺氧誘導(dǎo)微環(huán)境等[3]。亮氨酸拉鏈腫瘤抑制因子2(leucine zipper tumor suppressor 2, LZTS2)基因是近年新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因[4]，其為腫瘤的治療提供新的方向。已有研究表明LZTS2在正常前列腺、卵巢組織中高表達，且與多種腫瘤包括鼻咽癌、肺癌、胃癌、乳腺癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等腫瘤發(fā)生、發(fā)展及患者預(yù)后具有相關(guān)性[5-8]。但有關(guān)LZTS2在TC中的表達及生物學(xué)作用尚未見相關(guān)報道。BRAF基因突變見于多種疾病，在TC中(尤其甲狀腺乳頭狀癌)以BRAFV600E基因突變發(fā)生率最高[9]，BRAFV600E基因突變與影響TC患者預(yù)后的因素如淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、包膜侵犯及TNM分期等有相關(guān)性。有研究表明[10]，LZTS2/LAPSER1基因與相關(guān)基因或蛋白在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中存在協(xié)同或抑制作用。本組通過免疫組化法檢測TC組織中LZTS2蛋白表達，并通過熒光PCR法檢測BRAFV600E基因突變情況，探討兩者相關(guān)性，著重分析LZTS2蛋白表達與TC臨床病理特征的關(guān)系，以期為TC患者的不良預(yù)后提供更多合理的生物標(biāo)志物，進而為臨床個體化治療提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選取鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科2016年1月～2019年10月經(jīng)病理確診的140例TC(包括48例甲狀腺乳頭狀癌、41例甲狀腺濾泡癌、23例未分化癌、28例髓樣癌)腫瘤組織作為實驗組，其中67例TC患者術(shù)前行超聲引導(dǎo)下甲狀腺結(jié)節(jié)細針穿刺新鮮組織BRAFV600E基因突變檢測，并選取82例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織作為對照組?；仡櫺苑治鰧嶒灲MTC患者的臨床病理資料。腫瘤TNM分期標(biāo)準(zhǔn)采用美國癌癥聯(lián)合會(American joint committee on cancer, AJCC)第8版標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)切片由兩位高級職稱病理醫(yī)師診斷；(2)患者在本次治療前未接受放、化療；(3)臨床與病理資料完善；(4)心、肝腎功能正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他類型惡性腫瘤；(2)臨床病理資料不齊全；(3)合并精神障礙者。

1.2 主要試劑兔抗人LZTS2單克隆抗體(ATLAS，克隆號R41398，稀釋濃度1 ∶100)；人類BRAF基因突變檢測試劑盒(北京雅康博生物公司)；DAB顯色試劑盒、SP試劑盒(美國Ventana公司)等。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定、脫水、包埋、切片和HE染色。免疫組化采用Ventana Benchmark XT自動免疫組化儀染色。顯微鏡(OLYMPUS BX41)下觀察LZTS2的表達。判讀標(biāo)準(zhǔn)：由兩位經(jīng)驗豐富的高級職稱病理醫(yī)師采用雙盲法在高倍顯微鏡下對染色結(jié)果進行觀察，主要觀察記錄陽性細胞率和著色強度，LZTS2陽性主要定位于細胞質(zhì)/膜。按陽性細胞百分比評分：陽性細胞率<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分；按著色強度評分：基本無陽性著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；兩項評分相乘為最終得分：0～4分為低表達，>4分為高表達。

1.3.2穿刺方法 甲狀腺結(jié)節(jié)細針穿刺檢查均為超聲引導(dǎo)下穿刺，操作嚴格遵循無菌原則。最后將穿刺注射器內(nèi)部分穿刺物快速推至含有1 mL生理鹽水的離心管中用于基因檢測。

1.3.3BRAFV600E基因突變檢測 使用QIAamp DNA Micro Kit提取穿刺組織DNA，按人類BRAF基因突變檢測試劑盒(北京雅康博公司)操作說明，采用PCR法判斷基因是否突變。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。率的比較采用χ2檢驗及Fisher精確概率法。多因素分析采用Logistic回歸分析，LZTS2蛋白表達與BRAFV600E基因突變的關(guān)系進行Pearson相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TC及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織中LZTS2的表達LZTS2蛋白主要定位于細胞質(zhì)/膜(圖1)，LZTS2在TC組織中的低表達率為37.14%(52/140)，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫中的低表達率為19.51%(16/82)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.565，P<0.05，表1)。此外，實驗組LZTS2在甲狀腺濾泡癌、未分化癌中的低表達率(41.46%、100%)與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫(19.51%)相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 TC及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織中LZTS2的表達[n(%)]

ABC圖1 A.甲狀腺乳頭狀癌中LZTS2高表達,EnVision法;B.結(jié)節(jié)性甲狀腺腫中LZTS2高表達,EnVision法;C.甲狀腺未分化癌中LZTS2低表達,EnVision法

2.2 LZTS2蛋白表達與TC臨床病理特征的關(guān)系TC組織中LZTS2蛋白表達與患者年齡、TNM分期、組織學(xué)類型、腫瘤直徑及病灶數(shù)目有關(guān)(P<0.05)；與患者性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及雙側(cè)甲狀腺受累均無關(guān)(P>0.05，表2)。多因素Logistic回歸分析顯示，LZTS2蛋白低表達與TC不同組織學(xué)類型顯著相關(guān)(OR=0.33，95%CI：0.16～0.72，P<0.05)。

表2 LZTS2蛋白表達與TC臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 BRAFV600E基因突變檢測實驗組中67例TC患者行超聲引導(dǎo)下甲狀腺結(jié)節(jié)細針穿刺新鮮組織檢測BRAFV600E基因突變情況。甲狀腺乳頭狀癌BRAFV600E基因突變率為95.45%(42/44)，髓樣癌及濾泡癌均未合并BRAFV600E基因突變。單因素分析顯示，BRAFV600E基因突變與TC不同組織學(xué)類型具有相關(guān)性(P<0.001，圖2、3)。

圖2 A.甲狀腺乳頭狀癌HE染色；B.熒光PCR檢測示BRAFV600E基因突變型

圖3 A.甲狀腺未分化癌：梭形腫瘤細胞間質(zhì)內(nèi)彌漫浸潤性生長；B.熒光PCR檢測示BRAFV600E基因野生型

2.4 LZTS2表達與BRAFV600E基因突變的關(guān)系本組TC中LZTS2蛋白表達與BRAFV600E基因突變無明顯相關(guān)性(r=0.225，P=0.067，表3)。

表3 TC中LZTS2表達與BRAFV600E基因突變的關(guān)系[n(%)]

3 討論

TC屬于頭頸部常見的惡性腫瘤，發(fā)病率逐年升高，主要與臨床影像學(xué)檢查的普及、細針穿刺細胞學(xué)診斷水平的提高有關(guān)[11]。TC組織學(xué)類型包括乳頭狀癌、濾泡癌、未分化癌及髓樣癌，其中以乳頭狀癌最為常見且患者預(yù)后較好，未分化癌患者預(yù)后最差[12]。目前TC發(fā)生、發(fā)展機制尚不完全明確，深入探討TC可能的發(fā)生機制，可為TC的早期預(yù)防及后期治療提供更多實驗依據(jù)，且對于改善患者預(yù)后有重要臨床意義。

LZTS屬于富含亮氨酸重復(fù)序列超家族蛋白，主要包括LZTS1和LZTS2。LZTS2是近年發(fā)現(xiàn)的包含3個亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的蛋白，LZTS2/LAPSER1基因位于人類染色體10q24.3[13]。LZTS2蛋白N-末端的PGS富集區(qū)和SGP富集區(qū)和C-末端的谷氨酸富集區(qū)是其結(jié)合于各轉(zhuǎn)錄因子的重要結(jié)構(gòu)，其含有3個結(jié)構(gòu)域可以直接結(jié)合DNA的啟動子或增強子，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。LZTS2蛋白在很多正常組織中高表達，但在腫瘤組織(如肺癌、結(jié)腸癌、膠質(zhì)瘤及前列腺癌等)中低表達，也提示LZTS2可能是一種發(fā)揮抑癌作用的蛋白[14]。但有關(guān)LZTS2蛋白在TC組織中的表達及生物學(xué)作用尚未見報道。本實驗通過免疫組化法檢測TC及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織中LZTS2蛋白的表達，結(jié)果顯示TC組織中LZTS2蛋白顯著低表達，與文獻報道一致。Cui等[6]研究發(fā)現(xiàn)，非小細胞肺癌中LZTS2/LAPSER1表達率較低，且LZTS2/LAPSER1過表達與非小細胞肺癌類型、腫瘤狀態(tài)和淋巴結(jié)侵襲情況有關(guān)。本組通過單因素分析發(fā)現(xiàn)，TC組織中LZTS2低表達與組織學(xué)類型(濾泡癌低表達率41.46%、未分化癌低表達率100%)有相關(guān)性，且多因素分析結(jié)果顯示組織學(xué)類型是LZTS2低表達的獨立影響因素，與以往研究認為LZTS2主要發(fā)揮抑癌作用的觀點一致。但本實驗還發(fā)現(xiàn)，甲狀腺乳頭狀癌、髓樣癌組織中LZTS2蛋白高表達，與部分文獻報道不一致[7]，考慮可能與TC病變發(fā)生發(fā)展過程中存在LZTS2/LAPSER1基因突變的現(xiàn)象有關(guān)。LZTS1和LZTS2屬于同一家族的抑癌基因，王欣欣等[15]通過對肝癌中LZTS1蛋白表達的研究發(fā)現(xiàn)，對比正常肝細胞，肝癌細胞系HepG2中LZTS1表達反向增強。由此作者考慮LZTS2蛋白在部分TC組織中可能也存在類似的反向表達，但仍需后續(xù)進一步深入研究證實。本組LZTS2蛋白表達與患者年齡、腫瘤TNM分期、腫瘤直徑及病灶數(shù)目有相關(guān)性，提示LZTS2蛋白表達可能與TC病情進展及患者預(yù)后有關(guān)。

作為RAF基因家族中的一種，BRAF基因突變見于多種疾病，尤以BRAFV600E基因突變與TC發(fā)生最具相關(guān)性，甲狀腺惡性結(jié)節(jié)(乳頭狀癌)中BRAFV600E基因突變率為64.58%，而良性結(jié)節(jié)不合并BRAFV600E基因突變[16]。本組甲狀腺乳頭狀癌BRAFV600E基因突變率為95.45%(42/44)，高于文獻報道結(jié)果，可能與研究對象選擇、樣本量及檢測方法不同等因素有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)[10]LZTS2/LAPSER1基因與相關(guān)基因或蛋白在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中存在協(xié)同或抑制作用。本實驗結(jié)果顯示LZTS2蛋白表達與BRAFV600E基因突變不具有相關(guān)性，提示兩者在TC發(fā)生、發(fā)展過程中可能各自發(fā)揮不同的影響作用。

綜上所述，本組通過免疫組化法、單因素及多因素分析發(fā)現(xiàn)，LZTS2蛋白在TC組織(濾泡癌、未分化癌)中呈低表達，間接證實在甲狀腺組織中LZTS2也是一種發(fā)揮抑癌作用的蛋白。LZTS2蛋白表達與BRAFV600E基因突變不具有相關(guān)性，兩者在TC發(fā)生、發(fā)展過程中可能各自發(fā)揮不同的作用，LZTS2有望成為TC早期預(yù)警生物學(xué)標(biāo)志物。有關(guān)LZTS2在TC中的具體作用機制尚不清楚，尚需進一步的實驗來驗證。