陳秀慧，曲軍英，林 瑤，陳秀玲

子宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，美國每年新發(fā)病例超10 000例，死亡病例超4 000例[1]。在部分發(fā)達(dá)國家，由于篩查和治療水平的提高，子宮頸癌的發(fā)病率和病死率有所改善，但在某些非洲和亞洲國家的情況卻不容樂觀，2015年發(fā)布的中國癌癥統(tǒng)計報告顯示，子宮頸癌的發(fā)病率和病死率逐年增加，34～44歲女性中子宮頸癌的發(fā)病率排名位居第二，嚴(yán)重威脅我國女性的生命健康[2]。近年來，盡管放療、化療和外科手術(shù)等治療手段不斷進(jìn)步，但子宮頸癌患者的5年生存率仍然不足50%[3]，因此探索子宮頸癌新的治療手段仍是重要問題。與肝細(xì)胞癌預(yù)后不良相關(guān)長鏈非編碼RNA(associated with poor prognosis of hepatocellular carcinoma long non-coding RNA, lncRNA AWPPH)是新近發(fā)現(xiàn)的致癌長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)，其與肝癌、胃癌和骨肉瘤等腫瘤的增殖和侵襲惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)[4-6]，但lncRNA AWPPH在子宮頸癌中的作用尚不清楚。miR-203a表達(dá)異常可導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生[7-8]，在子宮頸癌中miR-203a-5p作為lncRNA WT1-AS的直接靶標(biāo)，可調(diào)節(jié)子宮頸癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲[9]，但miR-203a在子宮頸癌中的表達(dá)尚未見相關(guān)報道。文獻(xiàn)報道胃癌中miR-203a與lncRNA AWPPH具有結(jié)合位點[5]。本文通過觀察lncRNA AWPPH和miR-203a在子宮頸癌中表達(dá)，初步探討lncRNA AWPPH和miR-203a調(diào)控子宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般資料收集2011年7月～2015年6月上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院診治的子宮頸癌75例。患者年齡(56.24±10.51)歲，>50歲者48例，≤50歲者27例；其中鱗癌40例，腺癌35例；按照國際婦產(chǎn)科協(xié)會(FIGO)和國際婦科腫瘤協(xié)會(IGCS)共同制定的《婦科惡性腫瘤分期及臨床實踐指南》[10]標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰa期26例，Ⅰb期16例，Ⅰc期14例，Ⅱa期12例，Ⅱb期7例；分化程度：中+高分化55例，低分化20例；無肌層浸潤38例，有肌層浸潤37例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例。另收集同期我院行子宮全切手術(shù)患者的正常子宮頸上皮組織樣本40例，患者年齡(54.61±12.63)歲，與子宮頸癌患者年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本實驗經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過，患者及家屬均知情同意，并簽署知情同意書。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者均為初次治療；(2)標(biāo)本在我院行穿刺或手術(shù)獲得，并經(jīng)病理專家確診為子宮頸癌組織；(3)未接受過抗腫瘤治療；(4)臨床資料和隨訪資料完整；(5)未發(fā)生遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移；(6)無個人腫瘤病史；(7)未合并心、肝、腎及肺功能障礙。

1.2 實驗試劑與儀器總RNA提取試劑Trizol購自美國Invitrogen公司，氯仿、異丙醇以及無水乙醇等相關(guān)試劑購自濟(jì)南蕭試化工公司；SYBR Premix Ex TaqⅡ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；OneStep RT-PCR Kit試劑盒購自德國QIAGEN公司；lncRNA AWPPH、miR-203a和內(nèi)參U6引物由上海生工公司合成；Nanodrop2000核酸測定儀購自美國Thermo公司；qRT-PCR儀購自美國BIO-RAD公司。

1.3 RNA抽提和qRT-PCR取100 mg新鮮組織剪碎后在研缽中進(jìn)行研磨，加入1 mL Trizol試劑完全裂解組織后移至EP管中，加入200 μL氯仿混勻后超低溫冰箱離心30 min，吸取500 μL水相層溶液與500 μL異丙醇混勻后超低溫冰箱離心15 min，無水乙醇洗滌2次，無RNA酶水溶解RNA，測得RNA濃度和純度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟將總RNA合成為cDNA。以cDNA為模板，按照SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒說明書配制qRT-PCR反應(yīng)體系，cDNA模板1 μL、ddH2O 3 μL、上下游引物各0.4 μL、SYBR Premix EX TaqⅡ10 μL、ROX Reference Dye 0.2 μL，總體積10 μL。于qRT-PCR儀上機(jī)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃，30 s，合計40個循環(huán)，并獲得各樣品的循環(huán)閾值(cycle threshold, Ct)。以U6基因為內(nèi)參，用2-ΔΔCt公式計算lncRNA AWPPH和miR-203a的相對表達(dá)量。lncRNA AWPPH上游引物5′-CTGGAT GGTCGCTGCTTTTTA-3′，下游引物5′-AGGGGGAT GAGTCGTGATTT-3′；miR-203a上游引物5′-CCGGT GAAATGTTTAGGACCACTAG-3′，下游引物5′-GCC GCGTGAAATGTTTAGG-3′；內(nèi)參U6上游引物5′-GATTCCTATGTGGGCGACGAG-3′，下游引物5′-CC ATCTCTTGCTCGAAGTCC-3′。

1.4 隨訪患者術(shù)后每隔3個月隨訪1次，通過電話或門診詢問方式進(jìn)行隨訪，隨訪時間為患者死亡或截止到2018年1月。其中，隨訪時間最長為70個月，最短為21個月。

2 結(jié)果

2.1 子宮頸組織中l(wèi)ncRNA AWPPH和miR-203a的表達(dá)采用qRT-PCR檢測lncRNA AWPPH、miR-203a在75例子宮頸癌組織和40例正常子宮頸組織中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：lncRNA AWPPH在子宮頸癌組織中的表達(dá)水平(1.81±0.87)高于正常子宮頸組織(1.00±0.46)(t=5.486，P<0.001，圖1A)，提示lncRNA AWPPH表達(dá)增多可能與子宮頸癌的發(fā)生相關(guān)。miR-203a在子宮頸癌組織中的表達(dá)(0.77±0.43)低于正常子宮頸組織(1.00±0.39)(t=2.820，P=0.006，圖1B)，提示miR-203a表達(dá)降低可能與子宮頸癌的發(fā)生相關(guān)。

圖1 子宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA AWPPH(A)和miR-203a(B)的表達(dá)

2.2 子宮頸癌中l(wèi)ncRNA AWPPH、miR-203a表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系子宮頸癌組織中，lncRNA AWPPH表達(dá)與患者年齡、組織類型、分化程度和肌層浸潤均無關(guān)(P>0.05)，與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P<0.05)；miR-203a表達(dá)與患者年齡、組織類型和肌層浸潤均無關(guān)(P>0.05)，與臨床分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)(P<0.05，表1)。

表1 子宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA AWPPH和miR-203a表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 子宮頸癌中l(wèi)ncRNA AWPPH、miR-203a表達(dá)對患者預(yù)后的影響繪制Kaplan-Meier生存曲線，采用Log-rank檢驗分析lncRNA AWPPH和miR-203a表達(dá)對子宮頸癌患者預(yù)后的影響。根據(jù)lncRNA AWPPH在子宮頸癌中的表達(dá)水平分為lncRNA AWPPH高表達(dá)組(≥1.81，42例)和lncRNA AWPPH低表達(dá)組(<1.81，33例)，lncRNA AWPPH高表達(dá)患者的預(yù)后比lncRNA AWPPH低表達(dá)患者差(Log-rank χ2=4.61，P=0.032，圖2A)。根據(jù)miR-203a在子宮頸癌組織中的表達(dá)水平分為miR-203a高表達(dá)組(≥0.77,36例)和miR-203a低表達(dá)組(<0.77,39例)，miR-203a低表達(dá)患者的預(yù)后比miR-203a高表達(dá)患者差(Log-rank χ2=5.58，P=0.018，圖2B，表2)。

表2 子宮頸癌中l(wèi)ncRNA AWPPH、miR-203a表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

圖2 lncRNA AWPPH(A)和miR-203a(B)表達(dá)對子宮頸癌患者預(yù)后(全因死亡)的影響

2.4 Cox多因素分析影響子宮頸癌患者預(yù)后的因素建立Cox比例風(fēng)險回歸模型，以本實驗資料為樣本，以預(yù)后狀況為應(yīng)變量，賦值1=死亡，0=生存，t=生存期。自變量選擇了臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、lncRNA AWPPH表達(dá)、miR-203a表達(dá)等5個指標(biāo)。回歸過程采用逐步后退法，以進(jìn)行自變量的選擇和剔除，設(shè)定α剔除=0.10，α入選=0.05?；貧w結(jié)果顯示：lncRNA AWPPH高表達(dá)(P=0.007)、miR-203a低表達(dá)(P=0.014)均是影響子宮頸癌患者預(yù)后不良的顯著影響因素(表3)。

表3 Cox多因素分析影響子宮頸癌患者預(yù)后不良的獨立危險因素

2.5 子宮頸癌中l(wèi)ncRNA AWPPH和miR-203a表達(dá)的相關(guān)性Pearson相關(guān)性分析子宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA AWPPH與miR-203a的表達(dá)相關(guān)性，結(jié)果顯示lncRNA AWPPH與miR-203a表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P=0.001，表4)。

表4 子宮頸癌中l(wèi)ncRNA AWPPH和miR-203a表達(dá)的關(guān)系

3 討論

目前子宮頸癌的治療手段并不能改善患者的預(yù)后，但在分子水平上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了針對致癌分子的特殊藥物，這些藥物不僅可以特異性抑制腫瘤的進(jìn)展，還可以避免化療和放療等治療產(chǎn)生的毒副反應(yīng)，同時隨著分子生物學(xué)的研究進(jìn)展，子宮頸癌的靶向治療取得了顯著進(jìn)展，抗血管生成、免疫檢查點抑制劑和表皮生長因子受體阻斷劑等靶向藥物也不斷出現(xiàn)[11]。新興證據(jù)表明，lncRNA在包括腫瘤在內(nèi)的各種人類疾病中發(fā)揮著重要作用，lncRNA是一組沒有蛋白質(zhì)編碼潛能的長度大于200個核苷酸的大轉(zhuǎn)錄本，其可以通過調(diào)控靶標(biāo)參與細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡和化療耐藥性等多種病理生理過程，可能是腫瘤治療的潛在靶標(biāo)[12-13]。

越來越多的lncRNA被發(fā)現(xiàn)，其中l(wèi)ncRNA AWPPH是由Zhao等[4]采用數(shù)據(jù)庫和qRT-PCR在肝細(xì)胞癌中鑒定新型lncRNA，其在肝細(xì)胞癌組織中呈高表達(dá)，與包囊不完全、微血管浸潤和TNM晚期有關(guān)，并且lncRNA AWPPH高表達(dá)是預(yù)后不良的獨立預(yù)后因素，因此其被命名為與肝細(xì)胞癌預(yù)后相關(guān)的lncRNA。近年來lncRNA AWPPH在其他惡性腫瘤中的作用也逐漸被發(fā)現(xiàn)，在骨肉瘤組織和細(xì)胞中l(wèi)ncRNA AWPPH高表達(dá)，并且其可以促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和抑制細(xì)胞凋亡[6]。lncRNA AWPPH在三陰型乳腺癌血漿中高表達(dá)，從而能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和降低細(xì)胞對卡鉑治療的敏感性[14]。本實驗中qRT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常子宮頸組織相比，lncRNA AWPPH在子宮頸癌組織中表達(dá)上調(diào)，且lncRNA AWPPH表達(dá)與子宮頸癌患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良相關(guān)。Li等[15]報道發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤組織中l(wèi)ncRNA AWPPH高表達(dá)與患者晚期、腫瘤大小、轉(zhuǎn)移和低生存率有關(guān)；Huo等[16]的報道也顯示，lncRNA AWPPH高表達(dá)非小細(xì)胞肺癌患者的生存時間明顯縮短，并且其與局部和遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)相關(guān)，與本實驗結(jié)果相似。

RNA轉(zhuǎn)錄物中包含共享miRNA的響應(yīng)元件，miRNA通過共享響應(yīng)元件相互連接發(fā)揮功能，即miRNA可作為競爭內(nèi)源性RNA(ceRNA)發(fā)揮功能。越來越多的證據(jù)表明，lncRNA可以作為內(nèi)源性miRNA的ceRNA來調(diào)節(jié)靶標(biāo)[12-13]。Li等[5]報道顯示，胃癌中miR-203a與lncRNA AWPPH具有結(jié)合位點，lncRNA AWPPH為miR-203a的ceRNA，兩者表達(dá)相反。本實驗中Pearson等級相關(guān)性分析顯示子宮頸癌中l(wèi)ncRNA AWPPH和miR-203a兩者的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性，表明在子宮頸癌中l(wèi)ncRNA AWPPH可能作為ceRNA負(fù)調(diào)控miR-203a的表達(dá)。miR-203a在多種腫瘤中表達(dá)異常，但在不同腫瘤中其發(fā)揮的作用并不相同，有報道結(jié)腸癌組織中miR-203a表達(dá)上調(diào)，其可以促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、集落形成以及遷移和侵襲[7]；miR-203a在卵巢癌組織中表達(dá)下調(diào)，且與FIGO分期、分級和預(yù)后有關(guān)，過表達(dá)miR-203a能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期[8]。本實驗qRT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常子宮頸組織相比，miR-203a在子宮頸癌組織中表達(dá)降低，且miR-203a表達(dá)與子宮頸癌患者臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良相關(guān)，這與miR-203a在卵巢癌中的研究結(jié)果具有一致性，表明miR-203a在子宮頸癌中發(fā)揮抑癌基因的作用，提示lncRNA AWPPH可能作為miR-203a的ceRNA促進(jìn)子宮頸癌的惡性進(jìn)展，但兩者的具體調(diào)控作用仍需后續(xù)深入研究。

另外本實驗采用Cox多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)lncRNA AWPPH高表達(dá)和miR-203a低表達(dá)是影響子宮頸癌患者預(yù)后不良的獨立危險因素，表明lncRNA AWPPH和miR-203a可能是子宮頸癌患者的潛在治療靶點和預(yù)后分子，且lncRNA AWPPH可能作為miR-203a的ceRNA促進(jìn)子宮頸癌的進(jìn)展，但具體的機(jī)制仍需在細(xì)胞水平中進(jìn)行后續(xù)研究。

綜上所述，子宮頸癌中l(wèi)ncRNA AWPPH呈高表達(dá)，miR-203a呈低表達(dá)，兩者均與患者不良病理參數(shù)和預(yù)后相關(guān)，兩者可能是子宮頸癌不良預(yù)后的獨立危險因子和治療候選靶標(biāo)。