郭艷麗，王會恩，尹 情，韓俊淑，郭 煒，沈素朋，梁 佳，董稚明

長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)在多種人類腫瘤中異常表達(dá)，失調(diào)的lncRNA可通過多種機(jī)制參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA DDX11-AS1在肝細(xì)胞癌[3]、結(jié)腸癌[4]、骨肉瘤[5]中均異常表達(dá)，但其在賁門腺癌(gastric cardia adenocarcinoma, GCA)中的表達(dá)及作用仍未完全闡明。本文著重探討DDX11-AS1在GCA中的表達(dá)及其與臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系，并進(jìn)一步探討DDX11-AS1對胃癌細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響，旨在闡明DDX11-AS1在GCA中可能發(fā)揮的作用，為GCA患者分子靶向治療提供候選分子靶點(diǎn)及預(yù)后評估提供有價(jià)值的指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料選取河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院2012～2014年收治的GCA患者136例，所有患者術(shù)前均未經(jīng)放、化療。患者臨床病理資料見表1。其中臨床分期依據(jù)美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)及國際抗癌聯(lián)盟(UICC)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類；腫瘤病理分級依據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類。每例患者均取癌組織原發(fā)灶及距癌組織2～5 cm處的癌旁組織，手術(shù)切除標(biāo)本一部分保存于-80 ℃低溫冰箱用于提取RNA，另一部分進(jìn)行石蠟包埋，常規(guī)HE染色，經(jīng)病理醫(yī)師診斷證實(shí)均為GCA，癌旁組織均為正常黏膜組織。對136例GCA患者進(jìn)行隨訪，其中11例失訪。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查通過，入選患者均簽署知情同意書。

MGC803、BGC823、SGC7901、HGC27胃癌細(xì)胞株由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤研究所病理研究室留存并傳代。Trizol購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Reverse Transcription System A3500)、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、MTS試劑均購自美國Promega公司；RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，Transwell小室購自美國Corning公司，Matrigel膠購自美國BD Biosciences公司，siRNA由中國GenePharma公司合成，所用引物均由上海生工公司合成。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 常規(guī)培養(yǎng)MGC803、BGC823、SGC7901、HGC27胃癌細(xì)胞株。待細(xì)胞處于指數(shù)分裂期時，胰酶消化BGC823，接種細(xì)胞于6孔板中，待板中細(xì)胞匯合度至70%時，按Lipofectanine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。siRNA引物序列如下：siRNA1，5′-CTGTGTAGC TCTAGAGAAA-3′；siRNA2，5′-GGCCTTAAGTTTAGA GCAA-3′。轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，提取RNA，進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.2.2qRT-PCR法檢測DDX11-AS1表達(dá) 按Trizol試劑說明書提取組織及細(xì)胞株中總RNA，分別參照Promega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于檢測目的基因的表達(dá)情況，并以GAPDH作為內(nèi)參照。引物序列如下：DDX11-AS1上游引物5′-CAGCAACCTTTCTGGGAAGC-3′，下游引物5′-ACAAGAGCTGAGCTTGTCTTT-3′；GAPDH上游引物5′-AGGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′，下游引物5′-AGGGGTCATTGATGGCAACA-3′。結(jié)果采用相對定量法，目的基因的相對表達(dá)量用2-ΔΔCt表示，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt-ΔCt對照。

1.2.3MTS實(shí)驗(yàn)檢測DDX11-AS1對胃癌細(xì)胞BGC823增殖能力的影響 常規(guī)培養(yǎng)BGC823細(xì)胞，待細(xì)胞處于指數(shù)分裂期時，胰酶消化，將3×103個細(xì)胞接種于96孔板中，每組設(shè)置6個復(fù)孔。分別于細(xì)胞貼壁后0、24、48、72、96 h在每孔加入20 μL(500 μg/mL)MTS試劑，在37 ℃含5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。用酶標(biāo)儀在490 nm波長處檢測每個孔的吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測DDX11-AS1對胃癌細(xì)胞BGC823侵襲能力的影響 Transwell小室上腔加入20 μL Matrigel膠，并在37 ℃下孵育2 h。下腔加入含10%FBS的600 μL RPMI 1640。常規(guī)消化并懸浮BGC823細(xì)胞于無血清培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞密度接種于小室上腔(1×105個/孔)。培養(yǎng)24 h后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，并用0.1%結(jié)晶紫染色。最后，在顯微鏡下對5個隨機(jī)視野的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 GCA中DDX11-AS1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系首先應(yīng)用基因表達(dá)譜交互分析(gene expression profiling interactive analysis, GEPIA)(http://gepia.cancer-pku.cn/)和GENEBANK(https://www.ncbi. nlm.nih.gov/gene/100506119)在線數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站分析DDX11-AS1在各腫瘤組織及正常黏膜組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示DDX11-AS1在多個腫瘤組織中的表達(dá)均明顯高于正常黏膜組織，尤其在胃腺癌中差異高達(dá)數(shù)倍；而在多數(shù)正常黏膜組織中則表達(dá)較低(圖1)。進(jìn)一步應(yīng)用qRT-PCR檢測GCA及癌旁正常黏膜組織中DDX11-AS1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)癌組織中DDX11-AS1表達(dá)(8.813±6.243)明顯高于正常黏膜組織(2.671±1.970)(t=-10.942，P<0.001，圖2A)。與正常組織相比，136例GCA組織中，有123例表達(dá)上調(diào)，其中92例表達(dá)上調(diào)達(dá)2倍以上，15例表達(dá)上調(diào)高達(dá)10倍以上(圖2B)。癌組織中DDX11-AS1表達(dá)與GCA淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度及TNM分期有關(guān)(P<0.01)，與患者年齡、性別、病理分級無關(guān)(P>0.05，表1)。

圖1 GEPIA及NCBI網(wǎng)站預(yù)測各個腫瘤組織及正常黏膜組織中DDX11-AS1的表達(dá)：A.GEPIA網(wǎng)站預(yù)測DDX11-AS1在各腫瘤及相應(yīng)正常黏膜中的表達(dá)；B.GENEBANK數(shù)據(jù)庫(HPA RNA-seq)顯示DDX11-AS1在多個正常組織中的表達(dá)

圖2 qRT-PCR檢測GCA及癌旁正常黏膜組織中DDX11-AS1的表達(dá)：A.賁門正常組織及腫瘤組織中DDX11-AS1的相對表達(dá)；B.每一例GCA患者癌組織與正常組織中DDX11-AS1表達(dá)的比值

表1 GCA組織中DDX11-AS1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.2 DDX11-AS1對GCA患者生存期的影響根據(jù)DDX11-AS1在GCA組織中表達(dá)的均值將患者分為DDX11-AS1高表達(dá)組和低表達(dá)組，其中高表達(dá)組52例，低表達(dá)組84例。DDX11-AS1高表達(dá)組患者的5年存活率為7.69%(中位生存時間23個月)，低表達(dá)組患者的5年存活率為33.2%(中位生存時間49個月)，經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)分析顯示，DDX11-AS1高表達(dá)可明顯縮短GCA患者的生存期(χ2=19.146，P<0.001，圖3)；為排除混雜因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，Cox多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)，DDX11-AS1表達(dá)是GCA患者獨(dú)立的預(yù)后因素(表2)。

圖3 DDX11-AS1表達(dá)與GCA患者生存曲線分析

表2 GCA患者生存期的多因素分析

2.3 DDX11-AS1在胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)及對BGC823細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響隨機(jī)選取10例賁門正常黏膜組織的cDNA，按等比例混合后作為細(xì)胞表達(dá)的對照組。qRT-PCR結(jié)果顯示胃癌細(xì)胞株中DDX11-AS1表達(dá)均明顯高于對照組，尤其在BGC823細(xì)胞中的表達(dá)量最高(圖4A)。在BGC823細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染siRNA-DDX11-AS1(siRNA1、siRNA2)，siRNA1沉默效果較好(圖4B)。分別應(yīng)用MTS及Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測DDX11-AS1對BGC823細(xì)胞增殖及侵襲的影響。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的對照組相比，敲低DDX11-AS1表達(dá)(siRNA1組)可明顯降低胃癌細(xì)胞BGC823的增殖及侵襲能力(圖4C、D)。

圖4 DDX11-AS1對BGC823細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響：A.DDX11-AS1在胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)；B.qRT-PCR法檢測BGC823細(xì)胞中siRNAs的沉默效果；C.MTS檢測DDX11-AS1對BGC823細(xì)胞增殖能力的影響；D.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測DDX11-AS1對BGC823細(xì)胞侵襲能力的影響；pools.按等比例隨機(jī)混合10例賁門正常黏膜組織的cDNA；NC.轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的對照組；*P<0.05，**P<0.01

3 討論

GCA位于食管和胃之間的轉(zhuǎn)化區(qū)，是胃癌最具侵襲性的亞型，具有較高的轉(zhuǎn)移率[6-7]。早期轉(zhuǎn)移是GCA患者預(yù)后差、生存率低的主要原因[8-9]。臨床資料顯示GCA患者術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)50%[8]。河北省太行山地區(qū)是我國上消化道腫瘤高發(fā)區(qū)[10]，流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，盡管非賁門胃腺癌的發(fā)病率和病死率呈下降趨勢，但賁門癌的發(fā)病率卻穩(wěn)步上升[11-12]。不健康的生活方式、幽門螺桿菌感染、胃食管反流病、環(huán)境危險(xiǎn)因素以及多種遺傳、表觀遺傳因素與GCA風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[13-15]。目前，GCA發(fā)生、發(fā)展的確切分子機(jī)制仍不清楚。

lncRNA長度在200 nt到100 kb，參與了許多重要生物學(xué)過程[16]。全基因組轉(zhuǎn)錄分析顯示，在多種人類腫瘤中l(wèi)ncRNA表達(dá)高度異常[1,16]。越來越多的證據(jù)表明，lncRNA在許多與腫瘤進(jìn)展相關(guān)的基因調(diào)控中發(fā)揮著極其重要的作用，可以作為癌基因或抑癌基因驅(qū)動腫瘤的表型及進(jìn)程[17]。有文獻(xiàn)[3-5]報(bào)道DDX11-AS1在多種腫瘤中異常表達(dá)，并可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡等惡性生物學(xué)行為參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。如Li等[3]研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞癌中DDX11-AS1表達(dá)異常增高，其過表達(dá)明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲，并可通過抑制LATS2表達(dá)在肝癌發(fā)生過程中發(fā)揮癌基因的作用，為肝癌治療提供了潛在的治療靶點(diǎn)。Tian等[4]研究也發(fā)現(xiàn)DDX11-AS1通過調(diào)控miR-873/CLDN7軸促進(jìn)了結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展。同時，對骨肉瘤的研究提示DDX11-AS1可通過海綿吸附miR-873-5p上調(diào)DDX11的表達(dá)，并通過與IGF2BP2結(jié)合增強(qiáng)了DDX11 mRNA的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)了骨肉瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[5]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在GCA組織和胃癌細(xì)胞系中DDX11-AS1表達(dá)均明顯上調(diào)。DDX11-AS1在腫瘤組織中的高表達(dá)與GCA的侵襲性臨床病理特征(包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度和臨床分期等)有關(guān)聯(lián)，提示DDX11-AS1可能在GCA侵襲轉(zhuǎn)移等惡性進(jìn)程中扮演著重要角色。為明確DDX11-AS1表達(dá)對GCA患者生存期的影響，應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線繪制DDX11-AS1表達(dá)與GCA患者累積生存率的關(guān)系，并用Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，DDX11-AS1高表達(dá)明顯縮短了GCA患者的生存期，與不良預(yù)后密切相關(guān)。同時，利用Cox回歸模型進(jìn)行多因素分析，校正潛在的混雜變量，發(fā)現(xiàn)DDX11-AS1高表達(dá)可作為GCA患者的獨(dú)立預(yù)后因素。同時，功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示敲低DDX11-AS1明顯抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。因此，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為DDX11-AS1可能在GCA的惡性進(jìn)展中扮演著重要作用，并可能是GCA患者預(yù)后不良的潛在預(yù)測因子。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示DDX11-AS1在GCA中可能扮演著癌基因的作用，其高表達(dá)促進(jìn)了GCA的發(fā)生與發(fā)展，并有望成為GCA患者預(yù)后評估的候選分子標(biāo)志物。