徐 程，李 霄，馬淑穎，張 響，張智弘

葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma, UM)是來源于葡萄膜黑色素細胞的原發(fā)性眼內惡性腫瘤，約占所有黑色素瘤的5%，該腫瘤預后不良，一旦發(fā)生遠處轉移，則迅速引起患者死亡[1]。不同于歐美人群，UM在東亞人群中發(fā)病率較低，這也導致其在國內的臨床病理研究進展緩慢。近年隨著分子靶向和免疫治療的發(fā)展，我國已制定了相應的黑色素瘤臨床診療指南及規(guī)范化的病理診斷專家共識，但這些指南和共識主要針對皮膚及黏膜黑色素瘤[2]。目前，國內關于UM的系統(tǒng)性報道較少，本文分析22例UM的臨床病理學特征，旨在為其精準治療提供病理依據。

1 材料與方法

1.1 材料收集2013年1月～2019年6月江蘇省人民醫(yī)院病理學部診斷明確的原發(fā)性UM 22例(剔除眶周皮膚黑色素瘤、結膜黑色素瘤)，所有病例均具有完整的臨床病理資料，包括患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤最大直徑、腫瘤厚度，調取并復習所有HE切片、免疫組化切片。通過電話或門診病歷系統(tǒng)對患者進行隨訪。

1.2 病理分型目前UM仍沿用1980年改良Callender分型系統(tǒng)[3]：(1)梭形細胞A型，腫瘤細胞呈梭形，細胞核染色質細膩，無顯著核仁；(2)梭形細胞B型，腫瘤細胞呈梭形、有黏附感，常似合胞體，細胞核染色質粗糙呈雪茄樣，核仁顯著；(3)上皮樣型，腫瘤細胞呈上皮樣，黏附力差，胞質豐富、嗜伊紅，核仁大而圓；(4)混合型，大多是梭形細胞B型與上皮樣型混合。梭形細胞型及上皮樣細胞型的診斷均需該成分腫瘤細胞比例大于90%，否則診斷為混合型。

1.3 常用術語及標準(1)核分裂象：選取熱點區(qū)或代表性區(qū)域，按每平方毫米計數核分裂象個數(本實驗顯微鏡目鏡直徑22 mm，每高倍視野面積0.237 mm2，1 mm2相當于4.2個高倍視野)[2]。(2)淋巴細胞浸潤程度：黑色素瘤的腫瘤浸潤淋巴細胞是指在腫瘤細胞之間浸潤、破壞腫瘤細胞巢的淋巴細胞，不包括圍繞于腫瘤細胞周邊的淋巴細胞；并用浸潤淋巴細胞的密度和范圍來表示程度：無腫瘤浸潤淋巴細胞；有但不活躍(局灶區(qū)域有腫瘤浸潤淋巴細胞)；活躍(整個腫瘤彌漫淋巴細胞浸潤)[2]。

1.4 方法

1.4.1褪黑色素 切片4 μm厚，放入0.5%高錳酸鉀水溶液中1～2 h，蒸餾水洗5～10 s，2%草酸水溶液3～5 min，自來水洗5 min，顯微鏡下觀察黑色素是否褪黑(如果沒有褪黑，蒸餾水洗后重復第一步)。

1.4.2免疫組化 切片4 μm厚，免疫組化染色應用EnVision兩步法，所用一抗HMB-45、Melan-A、S-100、Ki-67、CKpan等均購自福州邁新公司，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.4.3基因檢測 按照試劑盒說明書提取基因組DNA(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit, QIAGEN公司)，顯微鏡下觀察HE切片，選擇腫瘤細胞豐富的區(qū)域(腫瘤成分>80%)刮入EP管，加裂解液。BRAF V600E突變檢測試劑盒購自廈門艾德生物公司，采用熒光PCR法擴增，按說明書步驟檢測BRAF V600E體細胞突變。

2 結果

2.1 臨床特征22例UM中男性10例，女性12例；年齡25～79歲(中位年齡58.5歲)；位于左眼10例，右眼12例；21例位于脈絡膜，1例位于睫狀體；腫瘤最大徑5～20 mm，中位值10.5 mm，腫瘤厚度3～15 mm，中位值8 mm。16例表現為視力下降、視物模糊，4例為眼前黑影，1例為眼前閃光感，1例為眼紅、眼部脹痛?；颊咝g前均行影像學評估，MRI主要表現為：平掃T1WI呈類圓形稍高或高信號，T2WI呈低信號，瘤體血供豐富，增強后呈強化不均；部分腫瘤內可合并出血，MRI上信號不均勻(圖1)。術后2例患者行鉑類化療，其余病例未輔以其他治療。

圖1 MRI左眼球后壁內側緣見類圓形異常信號，T1WI(藍色箭頭)呈稍高信號，T2WI(紅色箭頭)壓脂序列呈低信號

2.2 病理組織學特征及分型腫瘤肉眼呈扁橢圓形或“圓頂狀”，境界尚清(圖2)。鏡下形態(tài)豐富，細胞呈梭形或上皮樣，多形性、異型性顯著，核染色質粗糙，具有大小不等的核仁(圖3)，排列方式多樣，可圍繞血管呈假菊形團樣(圖4)，或呈條束狀、魚骨樣排列，或呈巢、團狀排列，多數病例腫瘤細胞產生豐富的黑色素，有時甚至遮蓋整張切片，必須通過褪黑色素方可觀察腫瘤細胞形態(tài)。免疫表型：腫瘤細胞穩(wěn)定表達HMB-45、Melan-A(圖5)、S-100。22例UM中，梭形細胞A型0例；梭形細胞B型9例：腫瘤細胞呈較一致的梭形，細胞間黏附力強，核染色質粗糙，呈雪茄樣，有核仁(圖6)；上皮樣型5例：腫瘤細胞大而不規(guī)則，呈顯著上皮樣，異型性更加顯著，細胞間黏附力差，胞質豐富、嗜伊紅，紅核仁大而顯著(圖7)；混合型8例：梭形細胞型和上皮樣型兩種形態(tài)均>10%，其中有3例出現了“氣球樣細胞”(圖8)，即胞質呈泡沫樣，富含脂質。

②③④⑤⑥⑦⑧⑨

2.3 核分裂象及淋巴細胞浸潤程度計數每平方毫米(本顯微鏡下約4.2個高倍視野)的核分裂象(圖9)，核分裂象總體個數為1～5個/mm2，中位值2個/mm2。腫瘤浸潤淋巴細胞整體不活躍，僅2例有少許腫瘤浸潤淋巴細胞，其余病例均無腫瘤浸潤淋巴細胞或其他免疫細胞。

2.4 BRAF基因檢測22例UM均行BRAF V600E突變檢測，結果均為野生型(圖10)。

圖10 熒光PCR檢測BRAF V600E均為野生型

2.5 隨訪22例中2例失訪，20例獲得隨訪資料，隨訪時間8～73個月(平均33.5個月)，1例術后26個月死亡，1例術后12個月發(fā)生肝臟轉移(該例轉移后隨訪4個月患者尚存活)，其余18例均無瘤生存。

3 討論

葡萄膜也稱眼色素膜，是眼球壁的第二層，分為前部的虹膜、中部的睫狀體和后部的脈絡膜。UM是成人最常見的原發(fā)性眼內惡性腫瘤，具有明顯的地區(qū)、種族差異，好發(fā)于高加索人群，亞非地區(qū)發(fā)病率較低，每年新發(fā)病例僅2～3/1 000萬；好發(fā)于中老年人，中國人群發(fā)病中位年齡45歲；無明顯性別差異[1]。腫瘤好發(fā)于單側眼球，雙側受累罕見，大多位于脈絡膜(90%)，少數位于睫狀體(6%)和虹膜(4%)[1]，本組僅1例位于睫狀體，其余均位于脈絡膜，與文獻報道相似。腫瘤早期臨床無明顯癥狀，部分可出現閃光感、飛蚊癥，或視力障礙，晚期腫瘤較大壓迫可引起眼球疼痛、充血、青光眼等[4]，本組病例臨床表現以視力下降、視物模糊為主，少數表現為黑影、閃光感或眼部脹痛。

黑色素腫瘤組織形態(tài)學譜系十分寬泛，腫瘤排列方式多樣，可圍繞血管呈假菊形團樣，可似肉瘤；呈條束狀、魚骨樣排列，也可似癌；呈巢團狀排列，腫瘤間質血竇較豐富；細胞多形性、異型性顯著，形態(tài)可呈長梭形、短梭形、上皮樣，唯一具有診斷價值并恒定出現的細胞學特征是清晰的紅核仁[5]；免疫組化標記HMB-45、Melan-A、S-100對UM的診斷有重要價值，也大大減低了其診斷難度，但認識和區(qū)分UM病理亞型對其預后具有重要價值。不同研究中各型黑色素瘤所占比例差異較大，這可能是由于地區(qū)和樣本量差異造成的[6-7]。上皮樣亞型侵襲性強、轉移風險高，患者5年生存率遠低于梭形細胞亞型[1]，但上皮樣細胞在腫瘤中所占的比例與患者預后的關系并不明確，有研究認為，無論比例，只要出現上皮樣細胞即提示腫瘤惡性程度更高，從而建議將其病理細胞學分型簡化，只需報告腫瘤中是否存在上皮樣細胞即可[8]，本實驗也支持此觀點，本組中1例患者術后26個月死亡，1例患者術后12個月發(fā)生肝臟轉移，這2例中均存在上皮樣細胞。改良Callender分型系統(tǒng)將梭形細胞型分為A型和B型，本組中均為B型，而國內其他對UM進行Callender分型的研究中，未將梭形細胞型黑色素瘤詳細分為梭形細胞A型及梭形細胞B型。事實上，梭形細胞A型的診斷需十分謹慎，A型細胞十分溫和，核染色質細膩，無顯著核仁，形態(tài)上類似神經纖維瘤或平滑肌瘤，更有人提出既往診斷的梭形細胞A型黑色素瘤實際上是梭形細胞色素痣[9]，但梭形細胞色素痣診斷標準更嚴格，細胞缺乏多形性和異型性，梭形細胞A型黑色素瘤的細胞有多少不等的多形性和異型性。本組中還發(fā)現有3例出現“氣球樣細胞”，文獻報道多出現于脈絡膜黑色素瘤，意義尚不明確，有研究認為這是由于色素的退變造成的，一般出現于腫瘤放、化療后[10]，本組有3例均位于脈絡膜，但術前均未行其他治療，出現此類細胞原因不明。

與皮膚黏膜黑色素瘤一樣，UM中出現高核分裂象也提示腫瘤的不良轉歸，《英國葡萄膜黑色素瘤國家指南》中推薦的核分裂象計數方法是計數40個高倍視野下的核分裂象[11]，但不同顯微鏡的高倍視野直徑有差異，故本實驗采用《中國黑色素瘤規(guī)范化病理診斷專家共識(2017版)》的標準，計數1 mm2的核分裂象[2]，與全身其他部位黑色素瘤標準統(tǒng)一。與皮膚黑色素瘤相比，UM的產色素能力更加顯著，有時黑色素覆蓋整張切片，實際工作中往往由于色素遮蓋或褪黑色素不成功導致核分裂象難以觀察，故一張高質量的褪黑色素片在UM的診斷中十分關鍵。

依據臨床特征、HE形態(tài)、免疫組化標記，UM的診斷一般較明確，需與其鑒別的腫瘤如下。(1)其他部位的黑色素瘤轉移至眼部，或眼部皮膚、結膜黑色素瘤累及葡萄膜：這往往提示腫瘤進入晚期，預后較差，其與葡萄膜原發(fā)黑色素瘤的起源不同、腫瘤分期也不同。(2)葡萄膜良性色素痣：其發(fā)病率較UM更低，診斷標準也更嚴格，腫瘤直徑多<5 mm、厚度<2 mm[12]，細胞形態(tài)溫和、缺乏多形性和異型性，核分裂象罕見[13]，形態(tài)上與梭形細胞A型UM難以鑒別。(3)葡萄膜神經鞘瘤：形態(tài)與軟組織神經鞘瘤相似，梭形細胞交替排列為束狀區(qū)(Antoni A區(qū))和網狀區(qū)(Antoni B區(qū))，常見柵欄狀結構及Verocay小體，免疫組化表達神經起源的標記S-100和SOX10，尤其要注意其與梭形細胞型UM的鑒別。

UM的預后與病理亞型相關，梭形細胞亞型的5年生存率約88%，上皮樣亞型和混合型5年生存率約60%，腫瘤一旦發(fā)生遠處轉移則患者多在1年內死亡，最常見的遠處轉移部位是肝臟(約90%)[14]，郭琳潔等[6]報道患者生存時間與腫瘤最大徑、最大高度及腫瘤的浸潤深度呈負相關。本組1例患者術后26個月死亡，1例患者術后12個月發(fā)生肝臟轉移，與文獻報道相似。由于病例數和隨訪時間的限制，本實驗未對其進行生存分析，故未來還需針對中國人群進行多中心大樣本的臨床病理及預后分析。提示UM預后不良的臨床參數：腫瘤體積較大(腫瘤最大徑與腫瘤厚度)、累及睫狀體、有眼外累及等；病理參數：出現上皮樣細胞、較高的核分裂象等，故一份規(guī)范化的UM病理報告需包含上述指標[11]。

BRAF是黑色素瘤最常見的基因變異，也是與治療最相關的靶點，其中約90%為V600E突變(谷氨酸取代纈氨酸)，我國黑色素瘤的BRAF突變率約25.5%[2]。不同于皮膚和黏膜，BRAF V600E基因突變在歐美UM人群中的檢測率極低，但中國人群的突變情況尚無大樣本的檢測數據，本組檢測22例BRAF V600E體細胞突變均為野生型，與歐美人群的檢測結果一致[15]，提示近年來獲批的BRAF突變靶向治療藥物對UM治療效果有限，同時提示UM有其獨特的分子遺傳學特點。編碼G蛋白Gα亞基的GNAQ、GNA11是近幾年發(fā)現的UM中最常見的驅動基因，在歐美人群中的突變率可高達80%，且GNA11在轉移灶中的突變率比GNAQ更高；該突變還存在于葡萄膜的色素痣、藍痣、中樞神經系統(tǒng)黑色素細胞瘤中，但該驅動基因在亞洲人群中的突變率較低，且目前尚無針對該基因的靶向治療藥物[15-16]。定位于染色體3p21.1的BAP-1，既往發(fā)現其與肺癌、乳腺癌、間皮瘤等多種惡性腫瘤相關，最近也被發(fā)現在84%的轉移性UM中失表達，BAP-1與內皮屏障功能相關，其失表達可使腫瘤細胞由眼部播散至體循環(huán)，最易播散于肝臟，故BAP-1蛋白與UM的遠處轉移相關，也提示不良預后[17]。此外，部分UM中還檢測出一些異常染色體核型：如3號染色體單倍體型、8號染色體多倍體型[15-16]。免疫逃避相關機制在UM中的研究尚處于起步階段，有研究對UM采用抗PD-L1免疫治療，僅3.6%的病例能從中獲益[16]，效果遠不如皮膚黑色素瘤敏感，這可能與其所處的腫瘤微環(huán)境相關，本組UM的腫瘤浸潤淋巴細胞極不活躍，也印證了這一點。

目前國內對于UM尚無規(guī)范化的診療指南，診斷上依賴影像學早期發(fā)現和精準的病理學評估，手術摘除眼球仍是一線治療方案，部分術后輔以放療、光療或廣譜化療，但療效并不確切[11]。

綜上所述，UM有其獨特的臨床、病理、分子遺傳學特征，不應簡單將其歸為全身黑色素瘤的一部分，皮膚、黏膜黑色素瘤的診療指南也不完全適用于UM；一份規(guī)范化的UM病理診斷報告需要包括腫瘤大小、病理亞型、核分裂象、腫瘤浸潤淋巴細胞、免疫組化結果等一系列參數；治療上除手術摘除眼球外，針對GNAQ、GNA11的分子靶向治療將成為晚期轉移性UM的研究熱點。