張熙 王東偉 曾凡榮 劉爽 馬雷 于祥菊

骨肉瘤是好發(fā)于兒童和青少年的骨惡性腫瘤，其特征是骨腫瘤細胞增殖產(chǎn)生類骨樣或未成熟骨基質(zhì)[1]。目前治療措施包括根治性保肢手術(shù)，術(shù)前新輔助化療，術(shù)后多藥聯(lián)合化療[2]。骨肉瘤的治療和檢查都需要采用外科手術(shù)，如活檢、病理切片和腫瘤切除等，而這些手術(shù)通常需要選用全身麻醉。研究表明，麻醉技術(shù)改變了分子環(huán)境可能會影響到癌細胞的功能，這可能是由于麻醉劑和阿片類藥物對疼痛的影響所導(dǎo)致[3]。據(jù)報道，麻醉會損傷人體免疫反應(yīng)，在手術(shù)刺激下使癌細胞更易擴散到周圍組織和循環(huán)內(nèi)[4]。由此可見，癌細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移更易發(fā)生在外科手術(shù)期間。各種麻醉藥物用于癌癥切除手術(shù)中，然而許多麻醉藥物對腫瘤的影響仍不清楚。因此，研究麻醉藥物對腫瘤的影響對腫瘤治療，減少腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率尤為重要。丙泊酚是一種廣泛而常用的靜脈麻醉藥物。最近，越來越多的證據(jù)表明丙泊酚能夠在體內(nèi)和體外影響腫瘤細胞的增殖、擴散和遷移[5，6]。因此，丙泊酚可能成為一種針對腫瘤手術(shù)較好的麻醉藥物[7]。然而，丙泊酚對骨肉瘤細胞的影響及其機制卻鮮有報道。本研究將探尋丙泊酚對人骨肉瘤細胞的影響及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) 人骨肉瘤U2OS細胞購于北納創(chuàng)聯(lián)生物公司。U2OS細胞37℃快速復(fù)蘇后，于McCoy’s 5A培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)重懸后，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞達90%時，0.25%胰酶消化傳代。細胞傳至4～5代后用于后續(xù)實驗。

1.2 實驗分組及處理 用DMSO將丙泊酚稀釋配制成1 μg/μl的丙泊酚溶液。按隨機數(shù)字法，分為4組。D組：在4 ml McCoy’s 5A培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中加入DMSO 4μl；P5組：將配制好的丙泊酚溶液20 μl 加入McCoy’s 5A培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中(培養(yǎng)基中丙泊酚濃度為5 μg/ml)；P10組：將配制好的丙泊酚溶液40 μl加入McCoy’s 5A培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中(培養(yǎng)基中丙泊酚濃度為10 μg/ml)；P20組：將配制好的丙泊酚溶液80 μl加入McCoy’s 5A培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中(培養(yǎng)基中丙泊酚濃度為20 μg/ml)。取對數(shù)生長期U2OS細胞按不同分組加入培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行后續(xù)實驗。

1.3 MTT法檢測細胞增殖 人骨肉瘤U2OS細胞加入96孔板中，培養(yǎng)達到對數(shù)生長期時按不同分組加入各濃度丙泊酚，每組設(shè)3個復(fù)孔。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12、24、36 h后，棄去藥物，各孔加入100 μl 培養(yǎng)基和10 μl MTT試劑，設(shè)置調(diào)零孔：無細胞培養(yǎng)基+MTT；對照孔：含細胞培養(yǎng)基+MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。酶標儀測定450 nm吸光度，公式：細胞抑制率(%)= [1-(試驗組吸光度-調(diào)零組吸光度)/(對照組吸光度-調(diào)零組吸光度)]×100% 計算細胞抑制率。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期人骨肉瘤U2OS細胞加入6孔培養(yǎng)板，5×105/孔培養(yǎng)24 h后，按分組加入不同濃度丙泊酚處理24 h后收集各組細胞，4℃ PBS洗滌2遍，重懸細胞至1×106/ml。取500 μl細胞懸液，分別加入Annexin-V FITC和PI染液各5 μl，室溫避光孵育15 min，流式細胞儀檢測，早期凋亡(FITC+，PI-)；晚期凋亡和死亡(FITC+，PI+)。

1.5 Western blotting檢測蛋白表達 收集各組處理24 h后細胞，PBS液洗3遍后13 000 r/min 離心15 min，棄上清。加入蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑(100∶1)，4℃靜置30 min，13 000 r/min 離心15 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度，將樣品蛋白和5×樣品緩沖液以4∶1 混勻，100℃煮沸10 min，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(PVDF膜甲醇浸泡激活)，37℃封閉1 h，加一抗，4℃過夜。TBST洗膜5 min/3次，加入辣根過氧化物酶標記二抗(1∶5 000)，室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次/5 min。以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參?；瘜W(xué)發(fā)光試劑ECL顯影，曝光。采用光密度掃描儀計算積分光密度，取與β-actin的比值反映蛋白的相對表達量。

1.6 ROS檢測 取對數(shù)生長期人骨肉瘤U2OS細胞加入6孔培養(yǎng)板，5×105/孔培養(yǎng)24 h后，按分組加入不同濃度丙泊酚處理24 h后收集各組細胞待測，按1∶500的比例用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，終濃度為20 μmol/L。將收集好的細胞懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細胞密度約1×106個。37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育60 min。1 000 r/min離心5 min收集細胞，PBS洗滌2遍，PBS重懸細胞。熒光酶標儀測定熒光強度，488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長，測定結(jié)果以熒光強度/毫克蛋白表示。

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚對人骨肉瘤細胞增殖的影響 不同濃度(5 μg/ml；10 μg/ml；20 μg/ml)分別作用于U2OS細胞12 h，24 h，36 h后，用MTT法檢測丙泊酚對細胞的增殖抑制率。結(jié)果顯示，D組生長抑制率分別為(40.8±0.5)%、(47.0±0.5)%、(47.2±0.4)%；P5組生長抑制率分別為(46.9±0.6)%、(61.5±0.4)%、(68.5±0.3)%；P10組生長抑制率分別為(61.2±0.2)%、(71.4±0.5)%、(79.1±0.2)%；P20組生長抑制率為(76.9±0.8)%、(80.7±0.2)%、(88.4±0.1)%。各組生長抑制率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，F(xiàn)=581.625)。見圖1。

圖1 不同濃度丙泊酚對U2OS細胞生長抑制率曲線

2.2 丙泊酚對人骨肉瘤細胞凋亡的影響 為了進一步檢測丙泊酚對人骨肉瘤細胞U2OS凋亡的影響，各組U2OS細胞經(jīng)丙泊酚處理24 h后，流式細胞儀檢測顯示，DMSO處理后U2OS細胞凋亡率僅為(1.6±0.5)%；5 μg/ml丙泊酚處理組U2OS細胞凋亡率為(11.8±2.4)%；10 μg/ml丙泊酚處理組U2OS細胞凋亡率為(23.3±4.8)%；20 μg/ml丙泊酚處理組U2OS細胞凋亡率為(33.8±3.3)%。4組間凋亡率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,F=53.386)?？梢婋S著丙泊酚濃度升高，U2OS細胞凋亡不斷增高，丙泊酚對U2OS細胞凋亡呈劑量濃度依賴性。見圖2。

圖2 不同濃度丙泊酚對U2OS細胞凋亡率的影響

2.3 丙泊酚對人骨肉瘤細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 為了進一步確認不同濃度丙泊酚對人骨肉瘤細胞凋亡的機制，western blotting檢測了其不同組中凋亡相關(guān)蛋白表達情況。結(jié)果顯示，隨著丙泊酚濃度的增加，凋亡通路的Cleaved Caspase-3及其下游Cleaved parp蛋白表達增高，P20組Caspase-3前體蛋白顯著減少；凋亡相關(guān)蛋白Bax上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2降低。其與內(nèi)參蛋白光密度比值差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖3，表1。

圖3 4組凋亡相關(guān)蛋白表達情況

表1 4組凋亡相關(guān)蛋白表達情況

2.4 丙泊酚對人骨肉瘤細胞ROS水平的影響 ROS熒光檢測結(jié)果顯示，D組U2OS細胞中ROS表達濃度為121.00±3.61(熒光強度/毫克蛋白)；P5組U2OS細胞中ROS表達濃度為169.67±2.08(熒光強度/毫克蛋白)；P10組U2OS細胞中ROS表達濃度為287.67±2.52(熒光強度/毫克蛋白)；P20組U2OS細胞中ROS表達濃度為294.33±4.16(熒光強度/毫克蛋白)；ROS表達水平隨丙泊酚濃度增加而增加(P<0.001，F(xiàn)=2187.827)。見圖4。

圖4 不同濃度丙泊酚處理U2OS細胞后ROS表達水平

3 討論

細胞凋亡是程序性細胞死亡的過程，通常發(fā)生在生長和衰老過程中，是維持生物組織中細胞群內(nèi)穩(wěn)態(tài)機制[8]。凋亡的進程由外在的死亡受體途徑以及內(nèi)在的線粒體介導(dǎo)凋亡通路啟動[9]，癌癥細胞的致癌作用和發(fā)病機理與這兩條凋亡通路的缺失有關(guān)[10]。細胞凋亡主要由半胱氨酸蛋白酶(Caspase)級聯(lián)和Bcl-2家族蛋白調(diào)控[11]。

Caspase是凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一種特殊蛋白質(zhì)，它的活化是細胞凋亡機制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。其中Capase-3是凋亡通路下游的最關(guān)鍵執(zhí)行者，Caspase-3被切割后將其下游的PARP切割成羧基端的催化結(jié)構(gòu)域(89 kD)和氨基端的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(24 kD)，PARP失去其酶活性使細胞不穩(wěn)定，最終導(dǎo)致DNA斷裂，參與凋亡途徑的最后階段。研究發(fā)現(xiàn)，藥物及射線等抗腫瘤治療通過Caspase依賴途徑導(dǎo)致骨肉瘤細胞凋亡[12]。在臨床麻醉中，全身麻醉的靶向血漿丙泊酚濃度為 3～8 μg/ml[13]。本研究中隨著丙泊酚濃度的增高，人骨肉瘤U2OS細胞活性減小，丙泊酚對U2OS細胞的抑制呈時間、劑量依賴性。并且western blotting的結(jié)果也顯示Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP蛋白表達的升高，以及20 μg/ml丙泊酚處理組的前體Caspase-3的顯著降低，表明丙泊酚使U2OS細胞發(fā)生了凋亡。

Bcl-2蛋白家族通過控制線粒體膜通透性，在調(diào)節(jié)內(nèi)在凋亡途徑方面起著重要的作用。Bcl-2家族中促凋亡蛋白(Bid、tBid、Bax等)和抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1 等)相互作用調(diào)控線粒體膜結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性[14]。而Bax/Bcl-2的比值是線粒體凋亡機制中的重要指標[15]，Bax/Bcl-2比值增高會持續(xù)開放線粒體外膜的膜滲透孔，釋放細胞色素C進入細胞質(zhì)，參與細胞進入線粒體凋亡通路的初始執(zhí)行階段[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚抑制人骨肉瘤MG63細胞的侵襲，并誘導(dǎo)細胞凋亡[17]。但對其細胞凋亡途徑尚未見具體報道。本研究中Bax蛋白表達隨丙泊酚濃度劑量依賴性增高，Bcl-2蛋白表達降低，這意味著丙泊酚對U2OS細胞的抑制可能是通過其內(nèi)在的線粒體凋亡途徑產(chǎn)生。

眾所周知，氧化應(yīng)激反應(yīng)尤其是活性氧自由基(ROS)聚集導(dǎo)致細胞凋亡在抗癌機制中起著至關(guān)重要的作用[18]。ROS直接或通過各種信號途徑使細胞內(nèi)脂類、蛋白質(zhì)及DNA等被氧化，尤其是線粒體蛋白遭受損害，引起細胞損傷[19]。丙泊酚由于其酚羥基與內(nèi)源性抗氧化劑維生素E結(jié)構(gòu)上類似，被認為有一定的抗氧化應(yīng)激作用，然而其本身又可介導(dǎo)細胞損傷。在其引起U2OS細胞凋亡機制中本研究繼續(xù)觀察了其細胞內(nèi)ROS水平，發(fā)現(xiàn)其隨著丙泊酚濃度的增加其ROS水平增加，表明丙泊酚對U2OS的凋亡作用與ROS的積聚及其氧化損傷機制有關(guān)，這也與一些研究中丙泊酚通過氧化應(yīng)激介導(dǎo)細胞損傷的結(jié)果[20]一致。因此，丙泊酚通過ROS積聚引起的氧化應(yīng)激導(dǎo)致了U2OS細胞凋亡。

雖然，本研究僅研究了丙泊酚對U2OS細胞的影響，其細胞種類較單一，培養(yǎng)環(huán)境與臨床研究仍有一定的差異。但研究發(fā)現(xiàn)了丙泊酚呈劑量依賴性導(dǎo)致U2OS細胞凋亡，并深入研究了其通過ROS增多的線粒體凋亡機制，為骨肉瘤手術(shù)治療的麻醉藥物選擇提供了一定的基礎(chǔ)研究依據(jù)。因此，更多的骨肉瘤細胞種屬以及動物研究及其更加深入的機制有待進一步研究。