李向勇，李春輝，粟玉剛，范 鐵，隆雪明

（1.長沙生態(tài)動物園，湖南長沙 410118；2.長沙市農業(yè)綜合行政執(zhí)法局，湖南長沙 410013；3.湖南省獸藥飼料監(jiān)察所，湖南長沙 410006）

毛首線蟲（或毛尾線蟲）也稱為鞭蟲（whipworm），屬于毛尾目（Trichurata）、毛尾科（Trichuridae）、毛尾屬（Trichuris），成蟲寄生于人與動物的盲腸[1-2]。毛首線蟲?。╰richuriasis）是人與動物常見的寄生蟲病，呈世界性分布，多分布于熱帶地區(qū)（包括中國），是一種容易被忽視的熱帶寄生蟲病[3]。據報道[4-5]，全球毛首線蟲感染人數為（6.04～7.95）億。金絲猴（Rhinopithecus roxellana）是我國特有的動物，被我國政府和《瀕危野生動植物種國際貿易公約》（CITES）列為一級保護物種[6]，被列入國際自然保護聯盟（IUCN）瀕危物種紅色名錄中的瀕危物種。現如今，金絲猴種群繁衍除了面臨棲息地被侵犯外，還有來自病毒和毛首線蟲的感染困擾[7]。因此，正確鑒定毛首線蟲種類，不僅具有重要學術價值，而且對預防和控制毛首線蟲病也具有重要的社會和經濟意義。

毛首線蟲的種內鑒定一直是國際性難題。毛首線蟲具有特殊的外形，雖然很容易鑒定到屬，但是種內鑒定只能靠蟲體大小、交合刺長度、交合刺鞘以及蟲卵等形態(tài)學特征進行鑒定[8]。當遇到形態(tài)相似性較高的蟲體和蟲卵時，傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定具有很大的局限性。如今，選用合適的基因分子標記，是寄生蟲分子分類學的首要任務。線粒體DNA（mtDNA）具有進化速度快、基因突變率高、母性遺傳等特點，是研究寄生蟲系統(tǒng)發(fā)生學、群體遺傳學和分子分類的理想分子標記[9-11]。而線粒體細胞色素c 氧化酶Ⅰ亞基（cox1）基因作為編碼基因，進化速度快，以母系遺傳為主，且不受基因重組、易位等激變影響，被國際DNA 條形碼聯盟推薦為首選基因[12]。本研究以采自長沙生態(tài)動物園金絲猴體內的毛首線蟲作為研究對象，通過PCR 擴增其部分cox1基因（pcox1）序列并進行分析，從而明確金絲猴毛首線蟲線粒體cox1基因部分序列能否成為理想的種間遺傳標記，旨在為今后金絲猴毛首線蟲的分類、鑒別及本病的防治等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 蟲體樣品

本試驗研究的6 條金絲猴毛首線蟲樣品于2017 年采自長沙生態(tài)動物園（金絲猴2016 年從上海野生動物園引進），樣品代碼標記為B-1、B-2、B-3、B-4、B-5、B-6。

1.2 主要試劑

蛋白酶K，購自Merck 公司；WizardTMDNA Clean-up System 試劑盒，購 自Promega 公 司；EmeraldAmp Max HS PCR Master Mix、DL 2 000 DNA Marker，均購自TaKaRa 公司。

1.3 樣品DNA 制備

先利用解剖顯微鏡觀察蟲體樣品的形態(tài)學結構，并用高清照相機拍下蟲體圖片進行初步形態(tài)學鑒定。樣品保存于裝有70%酒精的玻璃瓶中，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

從70%的酒精保存液中取出單個蟲體，用雙蒸水反復吹打沖洗3 次后，置于新的1.5 mL Eppendorf 管中；用滅菌的微型剪刀將蟲體組織剪碎，并反復研磨，然后根據WizardTMDNA Cleanup System 試劑盒說明書添加消化體系與20 μL 蛋白酶K；混勻后，放于55 ℃恒溫水浴箱中消化15～18 h；將消化好的混懸液再根據說明書提取蟲體DNA，DNA 樣品分裝后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR 擴增pcox1 基因

根據Bowles等[13]報道的引物JB3 和JB4.5（JB3：5'-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3'，24 bp；JB4.5：5'-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3'，24 bp）來擴增線粒體pcox1，隨后將引物交予生工生物工程（上海）股份有限公司合成。擴增體系為25μL：上下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，雙蒸水10.5 μL，EmeraldAmp Max HS PCR Master Mix 12.5 μL。PCR 過程：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共36 個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。取5 μL PCR 產物進行1%TAE 瓊脂糖凝膠電泳，用Good View Nucleic Acid Stain 染色，紫外投射儀下觀察結果，凝膠成像系統(tǒng)攝像。

1.5 pcox1 基因序列測定及系統(tǒng)發(fā)育樹構建

將PCR 產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結果用DNAstar 5.0 軟件分析，從GenBank 檢索現有毛尾科毛首線蟲屬毛首線蟲的cox1基因序列（表1），然后與之進行相似性比對并構建毛首線蟲系統(tǒng)發(fā)育樹，以旋毛蟲（Trichinella spiralis，KU321696.1）作為外群，利用ClustalX 1.81 及Mega 5.0 軟件對獲得的序列和GenBank 的毛首線蟲pcox1部分序列進行比對及遺傳距離計算，同時利用Mega5.0 程序中的鄰位相連法（Neighbor-Joining，NJ）反復運算1 000 次，選取最佳模型，繪制種系發(fā)育樹。

表1 代表性的毛首線蟲cox1 序列信息

2 結果與分析

2.1 形態(tài)學檢查

顯微鏡下觀察到雄蟲交合刺（圖1）和蟲卵（圖2），經反復對照文獻和寄生蟲圖譜結合蟲體照片（圖3～4），初步確定為金絲猴毛首線蟲（Trichuris rhinopiptheroxella）。

圖1 雄蟲交合刺

圖2 蟲卵

2.2 PCR 擴增

經PCR 擴增，6 個樣品均成功擴增出長度為411 bp 的基因片段，與預期pcox1基因目的片段長度相符，且無非特異性條帶，空白對照為陰性（圖5）。

圖3 雌蟲局部

圖4 蟲體

圖5 毛首線蟲線粒體pcox1 基因PCR 擴增結果

2.3 測序及分析

擴增所獲得的pcox1序列減除引物后長度一致，均為411 bp。將所測得的6 個樣本個體的pcox1序列進行種內比較，結果發(fā)現這些樣本的pcox1序列完全一致，無種內變異。序列中A、G、T、C 含量分別為26.52%、18.73%、36.74%、18.00%。其中A+T 含量（63.26%）明顯高于C+G含量（36.74%）。pcox1基因序列種間分析結果顯示，種間差異較大，差異率為24.0%～34.1%。

2.4 cox1 基因序列系統(tǒng)發(fā)生樹

采用NJ 法構建系統(tǒng)發(fā)生樹（圖6）。由圖6 可知，6 個樣本與GenBank 檢索到的Trichuris rhinopiptheroxella處于同一分支，同源性為100%，所在分支與其他毛首線蟲所在分支距離較遠。

3 討論

圖6 基于cox1 基因序列以NJ 法所構建的金絲猴毛首線蟲系統(tǒng)進化樹

寄生蟲的準確分類鑒定對寄生蟲病防治具有重要意義。但單靠傳統(tǒng)的形態(tài)學方法已經不能準確高效地進行寄生蟲分類鑒定。形態(tài)學分類方法存在一定局限性，尤其對于相似種或者近緣種，很難從形態(tài)上進行區(qū)分，而分子生物學的發(fā)展很好地解決了這一問題。線粒體cox1作為線粒體編碼基因，具有母系遺傳、進化速度快、受基因突變影響小等特點，被很多專家學者認為是種內遺傳學、分子分類學、分子進化學等學科理想的遺傳標記[14-17]。

本研究以長沙生態(tài)動物園金絲猴體內采集的毛首線蟲為樣本進行序列比對。發(fā)現分離的6 條金絲猴毛首線蟲種內相似性很高（100%），同時與GenBank 上檢索的Trichuris rhinopiptheroxella相似性也為100%，而與其他毛首線蟲種間差異較大，為24.0%～34.1%。系統(tǒng)發(fā)育分析結果顯示，毛首線蟲分離株與GenBank 上檢索的Trichuris rhinopiptheroxella處于同一分支，而與其他毛首線蟲分枝相隔較遠。依此判定，此次在長沙生態(tài)動物園金絲猴體內采集的毛首線蟲均為Trichuris rhinopiptheroxella。此次研究結果充分說明毛首線蟲的cox1基因序列種內保守而種間差異大，可以作為毛首線蟲分類學理想的遺傳標記，還為進一步研究毛首線蟲的群體遺傳結構奠定了基礎。