（中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032）

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae）正禽腮腺炎病毒屬（Orthoavulavirus），為單股負鏈RNA 病毒，可感染240 多種禽類。NDV 只有1 個血清型，但可分為多種基因型。根據(jù)病毒F基因序列差異，毒株可分為I 類（class I）和II 類（class II）兩大類。II 類NDV 流行時間較長，至少包括21 種基因型。歷史上引起5 次ND 大流行的毒株和常用疫苗株均屬于II 類NDV[1]。I 類NDV 只有1 個基因型，但可細分為3 個基因亞型[1]。2003 年I 類NDV 在法國野生麻鴨中被首次分離到，此后又出現(xiàn)于野生水禽和野鳥中，近年來又傳播至家禽[2-4]。2008 年通過病毒分離，我國首次證實I 類NDV 的存在，隨后研究發(fā)現(xiàn)病毒已在我國廣泛流行[5-6]?；仡櫺哉{(diào)查發(fā)現(xiàn)，2002 年在浙江、福建等地活禽市場檢出的病毒與其同類，說明I 類NDV 早已存在[7]。雖然I 類NDV 絕大多數(shù)為無毒株或弱毒株，但已有學者證實NDV 弱毒株可通過雞或雞胚連續(xù)傳代增強毒力[8-11]。我國養(yǎng)禽業(yè)發(fā)達，I 類NDV 污染面廣[12]且存在基因變異和毒力增強的風險。因此，對國內(nèi)家禽中攜帶的I 類NDV 進行長期系統(tǒng)監(jiān)測，掌握病毒分布和流行規(guī)律，對新城疫防控具有重要意義。本研究于2016—2019 年，按照《國家動物疫病監(jiān)測與流行病學調(diào)查計劃》，在我國23 個?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）998 個采樣點，隨機采集家禽口咽/泄殖腔雙拭子樣本、野鳥糞便樣本和環(huán)境樣本，通過病毒分離和常規(guī)RT-PCR 技術(shù)檢測I 類NDV，并對分離株進行遺傳進化分析，以期為科學防控新城疫提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本與雞胚

從國內(nèi)23 個?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）的批發(fā)市場、農(nóng)貿(mào)市場、養(yǎng)殖場和屠宰場，隨機采集不同種類家禽的口咽/泄殖腔雙拭子樣品和環(huán)境樣品，并在野鳥棲息地采集野鳥糞便樣品。SPF 雞胚，購自濟南斯帕法斯家禽有限公司。

1.2 病毒分離鑒定

按照國標《新城疫診斷技術(shù)》（GB16550—2008）規(guī)定方法，將采集的樣品接種9～11 日齡SPF 雞胚。每個樣品接種2 枚雞胚，37 ℃孵育，棄掉24 h 內(nèi)死胚；96 h 后，收獲雞胚尿囊液，進行血凝（HA）、血凝抑制（HI）試驗；分裝鑒定為NDV 陽性的尿囊液，-80 ℃保存。

1.3 RNA 提取

采用High Pure Viral RNA Kit（Roche）提取病毒RNA，將提取的RNA 立即用于RT-PCR 擴增或者于-20 ℃保存。

1.4 RT-PCR 鑒定

采用本實驗室建立的RT-PCR 方法[13]，利用Hiscript High Fidelity One Step RT-PCR Kit（Vazyme）擴增病毒F基因。引物序列見表1。RT-PCR 反應條件為：50 ℃ 30 min；94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃30 s，72 ℃ 30 s，進行35 個循環(huán)；72 ℃ 6 min。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，陽性樣品送青島睿博興科生物技術(shù)有限公司測序。

表1 I 類NDV 鑒定引物

1.5 遺傳進化分析

利用MEGA 6 軟件，對毒株F基因序列進行系統(tǒng)進化分析；采用鄰位相連法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果

2.1 I 類NDV 監(jiān)測

2016—2019 年，按照《國家動物疫病監(jiān)測與流行病學調(diào)查計劃》，在安徽、江蘇、上海等23個?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）開展了新城疫病原學主動監(jiān)測，在998 個采樣點共采集家禽口咽/泄殖腔拭子、野鳥糞便樣本和環(huán)境樣本45 458 份，經(jīng)病毒分離、RT-PCR 鑒定和序列測定，共分離到I類NDV 558 株，病毒陽性率為1.23%（95%CI，1.13%～1.33%）。其中，2018年I類NDV陽性率最高，為1.88%（表2）。558 株病毒主要來源于雞（403株）和鴨（126 株），少量來自鵝、鴿和環(huán)境樣本（表3）。野鳥糞便樣本中未檢測到病毒。

2016—2019 年分離的558 株I 類NDV 來源于安徽、福建、廣東、廣西、貴州、湖北、江蘇、江西、寧夏、上海、四川、云南、西藏、青海、新疆和浙江等16 個省（自治區(qū)、直轄市）的127 個采樣點，主要分布于我國華東、西南和西北地區(qū)，其中，廣東、廣西、江蘇、江西、寧夏、上海、云南等地連續(xù)4 年分離到I 類NDV。監(jiān)測到I 類NDV 的127 個采樣點包括，31 個活禽批發(fā)市場、91 個農(nóng)貿(mào)市場、3 個養(yǎng)殖場和2 個屠宰場?；钋菖l(fā)市場和農(nóng)貿(mào)市場年均病毒陽性率分別為28.70%和24.33%（圖1），明顯高于養(yǎng)殖場和屠宰場（P＜0.05）。

表2 2016—2019 年I 類NDV 主動監(jiān)測病原學檢測結(jié)果

2.2 I 類NDV 遺傳進化分析

遺傳進化分析結(jié)果（圖2）顯示：2016—2019年分離的558 株I 類NDV 分屬于2 種基因亞型：1.1.2 亞型551 株、1.2 亞型7 株。其中，1.1.2 亞型為目前我國家禽中流行的優(yōu)勢基因亞型，在我國16 個省（自治區(qū)、直轄市）家禽中均分離到；1.2基因亞型均為鴨源分離株，分別于2016 年和2018年分離自寧夏、江蘇和廣西等地。

3 討論

圖1 不同采樣點I 類NDV 陽性率分布

表3 2016—2019 年I 類NDV 宿主分布

圖2 2016—2019 年I 類NDV F 基因進化樹

1926 年3 月，印度尼西亞在爪哇島首次發(fā)現(xiàn)新城疫，隨后英格蘭、朝鮮、印度、斯里蘭卡、菲律賓、日本和澳大利亞等國也相繼報道發(fā)生新城疫。迄今為止，該病已蔓延至世界各地，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴重危害。毒株遺傳進化分析結(jié)果顯示，NDV 可分為I 類、II 類兩大類[14]。I 類NDV 出現(xiàn)較晚，2003 年首次在法國野生麻鴨中分離到，早期主要存在于野生水禽和野鳥中，隨后在活禽市場家禽中被陸續(xù)分離到[2-4]。早期基因分型方法將I 類NDV分為至少10 個基因型[2]，國內(nèi)流行毒株主要為基因2 型 和3 型[7，12]。2012 年，Diel 等[14]將I 類NDV 合并為1 個基因型，但細分為3 個基因亞型（1a、1b 和1c）。我國流行毒株主要為基因1b 亞型。2019 年，全球9 家OIE 新城疫參考實驗室聯(lián)合20 家國際著名實驗室更新了NDV 分類方法，將I 類NDV 劃分為1 個基因型3 個基因亞型（1.1.1、1.1.2 和1.2）[1]。我國早期分離株屬于1.1.1 和1.2基因亞型[5-6]。2016—2019 年我國分離的I 類NDV主要為1.1.2 基因亞型，只有7 株病毒屬于1.2 基因亞型。序列分析結(jié)果顯示，2016 年我國寧夏和江蘇分離的6 株1.2 基因亞型毒株與北美野生水鳥分離株高度同源。此類病毒于2015 年首次出現(xiàn)于我國廣西鴨群，但由于缺乏周邊國家新城疫監(jiān)測數(shù)據(jù)，至今仍不清楚該毒株的確切來源[15]。

我國I 類NDV 污染面廣。2016—2019 年我國16 個?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）127 個采樣點均分離到I 類NDV。2011—2015 年監(jiān)測數(shù)據(jù)表明，I類NDV 主要分布于我國華東、華中、華南和西南等東部和南部地區(qū)[12]。本研究結(jié)果顯示，近年來I類NDV 主要分離自我國華東、西南和西北地區(qū)，暗示病毒正逐漸從我國東部和南部向西部蔓延?；钋菖l(fā)市場和農(nóng)貿(mào)市場是I類NDV的高污染場點。本研究在活禽市場的雞、鴨、鵝、鴿等家禽和環(huán)境樣本中均分離到I 類NDV。部分活禽市場中，家禽免疫情況不明，多種禽類混養(yǎng)，市場衛(wèi)生條件較差，這些因素極易導致病毒傳播。因此，應加強活禽市場的生物安全管理，積極采取消毒、休市等措施。2017—2018 年，本研究在少數(shù)養(yǎng)殖場中也分離到I 類NDV。I 類NDV 雖為弱毒株，使感染雞不表現(xiàn)明顯臨床癥狀，但在雞體內(nèi)連續(xù)傳代后，可能通過基因變異增強毒力。因此，在家禽飼養(yǎng)過程中，應制定科學的免疫程序，做好疫苗免疫和抗體監(jiān)測，同時加強飼養(yǎng)管理，改善養(yǎng)殖環(huán)境，提高家禽抵抗力，降低病毒感染、變異和傳播的風險。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，我國I 類NDV 污染面廣，宿主范圍廣泛，且存在2 種基因亞型。建議加強飼養(yǎng)家禽I 類NDV 的免疫、監(jiān)測，同時加強飼養(yǎng)管理，提高家禽抵抗力，降低病毒基因變異使毒力增強的風險。