盛立彥，李美華，杜曉寧

(上?；ぱ芯吭河邢薰?上海穩(wěn)定同位素工程技術研究中心，上海 200062)

近年來，隨著色譜-質譜聯(lián)用技術以及穩(wěn)定同位素標記試劑的普及，同位素稀釋質譜法在食品安全檢測領域得到越來越廣泛的應用[1-7]。質譜法擁有極高的靈敏度及檢測專一性，而同位素內標則最大限度地消除了在前處理及色譜定量環(huán)節(jié)產生的誤差，并能避免質譜的基質效應，使得同位素稀釋質譜法被公認為最準確、靈敏的分析方法[8-11]。如今，越來越多種類的穩(wěn)定同位素標記試劑能通過有機合成法[12-16]甚至生物發(fā)酵法制備[17]，而化學純度(Chemical Purity)及同位素豐度(Isotope Enrichment)是其兩個重要的技術指標[18]。尤其是同位素豐度，低標記率內標物可能反而干擾目標物的檢測，從而影響定量分析的準確性。

目前，穩(wěn)定同位素標記試劑的同位素豐度測定方法以有機質譜法為主。鄭波等[18]提出采用液相色譜-質譜法表征美沙西汀-13C，將樣品引入到液相色譜進行分離，并對美沙西汀色譜峰中部分質譜數(shù)據(jù)進行“質量簇”法歸類處理，計算得到美沙西汀-13C的同位素豐度。蔡銀萍等[19]采用類似的方法對5個氘標記的蘇丹紅I-D5進行了同位素豐度測定及計算，并進行了方法學驗證。雷雯等[20]與侯捷等[21]則將“質量簇”法與氣相色譜-質譜聯(lián)用技術結合，分別分析了血液中及精氨酸發(fā)酵液中的氨基酸同位素豐度。但上述方法的數(shù)據(jù)處理中，未對如何在色譜峰上選取更有代表性的質譜圖開展研究。相比之下，若采用蠕動泵將樣品引入質譜，則能獲得更平穩(wěn)的離子流及差異更小的質譜圖。因此，在現(xiàn)行的化工行業(yè)標準中[22]，均規(guī)定了利用蠕動泵將樣品引入質譜，并采用“質量簇”法對穩(wěn)定同位素標記試劑如沙丁胺醇-D3、恩諾沙星-D5、敵百蟲-D6等的同位素豐度進行表征。然而，采用蠕動泵引入樣品需要耗費大量的時間——尤其是連續(xù)進樣相對分子質量相同或相近的樣品時，為了克服質譜的記憶效應，每兩次進樣之間需要多次用溶劑沖洗質譜的管路及離子源。另外，“質量簇”法中解多元線性方程組的環(huán)節(jié)也不利于大量樣品的數(shù)據(jù)處理。

本研究對照HG/T 4850.4，提出了一種采用液相色譜-質譜聯(lián)用法測定敵百蟲-D6同位素豐度的方法，并針對如何在色譜峰中選取合適的數(shù)據(jù)以使測定結果與蠕動泵法等效開展了研究。用液相色譜代替質譜蠕動泵引入樣品，能極大地減少人工操作環(huán)節(jié)，避免在連續(xù)樣品測試過程中主觀判斷帶來的影響(例如溶劑沖洗多長時間、何時開始采集數(shù)據(jù)等)，并能加快樣品分析的速度。同時，本研究優(yōu)化敵百蟲-D6同位素豐度計算方法，擬通過數(shù)學推理，用一個簡單的公式代替標準中規(guī)定的解七元一次方程組的步驟，以降低數(shù)據(jù)處理時間。

1 實驗材料

1.1 主要試劑

敵百蟲-D6：分析標準品，化學純度≥98.0%(HPLC)，Sigma-Aldrich公司產品；甲醇：HPLC級，德國Merck公司產品；甲酸：HPLC級，CNW公司產品；超純水為實驗室自制。

1.2 主要儀器

TSQ Quantum-Accela型液質聯(lián)用儀：美國ThermoFisher公司；Milli-Q型純水機：德國Merck公司。

2 實驗方法

2.1 工作溶液的制備

精確稱量敵百蟲-D6標準品5 mg，用1 mL甲醇溶解定容，制成約5 g/L的標準貯備液，并用甲醇將其逐級稀釋至1、0.1、0.01、0.001 g/L工作溶液備用。

2.2 液相色譜-質譜條件

色譜條件[23]：采用島津公司的Shim-pack GIST C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，3 μm)；流動相A為甲醇，流動相B為含0.1%甲酸的水溶液(V∶V)，采用VA∶VB=90∶10等度洗脫，流速為200 μL/min；進樣量為10 μL。

質譜條件：離子源采用ESI+模式，電噴霧電壓(Spray Voltage)為3 500 V，鞘氣 (Shealth Gas)流速為13 L/min，離子傳輸管溫度為275 ℃，掃描模式為全掃描(Full Scan)模式，掃描分辨率選擇為0.4 Da，采集的質荷比范圍為m/z=250～280 Da，掃描時間(Scan Time)為0.5 s。

若由蠕動泵直接進樣而不通過液相色譜分離，則參照標準要求，樣品引入速度為10 μL/min。

2.3 質譜數(shù)據(jù)的選取

采用蠕動泵引入樣品時，在獲得穩(wěn)定的離子流圖(TIC)后，采集10 s數(shù)據(jù)(20張質譜圖)并取平均質譜圖峰強度進行計算。

采用液相色譜引入樣品時，選擇以待測物保留時間為中心前后19張質譜圖進行疊加平均，并進行計算。

2.4 敵百蟲-D6同位素豐度計算方法(“質量簇”法)

敵百蟲-D6的質譜峰簇(m/z=257～269)對應的分子式應為(C4H3D6O4Cl3P)+，則其未經過氘標記的部分對應的元素組成應為(C4H3O4Cl3P)+，其天然豐度分布的占比(歸一化后)應為A251∶A252∶A253∶A254∶A255∶A256∶A257=0.412∶0.019∶0.399∶0.018∶0.130∶0.006∶0.015。

將所采集到的質譜圖中m/z=257,258,259,260,261,262,263的峰強度數(shù)據(jù)分別記為A0,A1,A2,A3,A4,A5,A6，代入以下方程組(1)計算，解xj(j=0,1,2,3,4,5,6)。

(1)

敵百蟲-D6的同位素豐度值以E表示，按式(2)計算：

(2)

2.5 敵百蟲-D6同位素豐度快速計算方法(線性公式法)

敵百蟲-D6的同位素豐度值以E表示，按式(3)計算：

E=(-0.251A0+0.185A1+0.324A2-

0.290A3-0.338A4+0.787A5+A6)/

(0.291A0+0.623A1+0.653A2+0.033A3-

0.012A4+0.954A5+A6)×100%

(3)

3 結果與討論

3.1 同位素豐度計算方法的簡化

3.1.1“質量簇”同位素豐度計算方法

“質量簇”法的同位素豐度計算方法一般分為三步：第一步為通過理論計算、模擬器或未標記的對照品實測結果得到待測分子未標記部分的天然同位素分布α0,α1,α2,…,αn；第二步為通過解線性方程組(如方程組1)將質譜數(shù)據(jù)去卷積，即扣除各質荷比質譜峰強度中由非同位素標記部分天然同位素豐度分布帶來的貢獻，還原得到不同標記數(shù)待測物摩爾分數(shù)x0,x1,x2,…,xn；第三步為按照同位素豐度的定義式(如式2)，代之以質譜解卷積結果，計算得到待測物的同位素豐度，即重原子標記率。

3.1.2計算方法簡化的數(shù)學推理

E=(a0A0+a1A1+a2A2+a3A3+

a4A4+a5A5+a6A6)/(c0A0+c1A1+

c2A2+c3A3+c4A4+c5A5+c6A6)×100%

由上述過程可見，本研究中的計算方法將“質量簇”法中原本對于每一個結果計算都需要解一個線性方程組的復雜流程轉化為一個共性的線性代數(shù)問題，從而將“質量簇”法的三個步驟簡化為一個線性計算式，降低了計算的難度，加快了計算速度。

3.2 質譜數(shù)據(jù)的選取

圖1a、1b分別為液相色譜及蠕動泵引入0.1 g/L敵百蟲-D6樣品時所采集到的離子流圖。當采用液相色譜引入樣品時(圖1b)，保留時間為1.57 min，峰起止時間為1.30 min～2.26 min，在此期間合計采集質譜圖112張。圖2a、2b、2c、2d、2e分別展示了t=1.37 min、t=1.47 min、t=1.57 min、t=1.67 min、t=2.17 min所對應的質譜圖。由圖2可見，這些質譜圖差異較大，且越靠近色譜峰的中心(保留時間)，質譜圖中m/z=257～262的相對強度越低；反之，越靠近色譜峰的邊緣(峰起止時間)，這些質譜峰的相對強度急劇增高。相比之下，當用蠕動泵引入樣品時(圖1a)，由于樣品的持續(xù)引入，所得到的離子流相對穩(wěn)定，不同時間對應的質譜圖之間差異不大(數(shù)據(jù)未展示)。

根據(jù)3.1討論的結果及式(3)可知，同位素豐度的測量結果由m/z=257～263質譜峰的相對峰強度直接決定，準確測量其值才能減小豐度結果的測量誤差。推測，m/z=257～263的質譜峰強度未必全部由待測物敵百蟲貢獻，溶劑等背景也有可能干擾測定(從而引入一部分誤差)。對于蠕動泵引入樣品的測定方法而言，這種背景維持在一個較穩(wěn)定且較低的水平(圖2f)。而由于液相色譜的分離能力，色譜峰上每一個時間點待測物濃度都不同，受背景基質效應干擾的程度也不同(圖2a～2e)——數(shù)據(jù)點的采集時間越接近待測物保留時間，待測物濃度越高，受基質效應的影響也越小，從而表現(xiàn)出在m/z=257～262處較低的質譜相對峰強度；反之，越接近峰的邊緣，待測物濃度越低，受基質效應影響則越嚴重，從而變現(xiàn)出m/z=257～262處質譜相對峰強度明顯高于圖2f。由此可見，如何在液質聯(lián)用離子流圖上選取質譜數(shù)據(jù)并進行平均，以使測定結果盡可能小地偏離蠕動泵法是方法替代的關鍵。

a——蠕動泵進樣；b——液相色譜進樣圖1 敵百蟲-D6離子流圖a——introduced by syringe pump;b——introduced by HPLCFig.1 TICs of Trichlorfon-D6

a——液相色譜進樣1.37 min質譜圖；b——液相色譜進樣1.47 min質譜圖；c——液相色譜進樣1.57 min質譜圖；d——液相色譜進樣1.67 min質譜圖；e——液相色譜進樣2.17 min質譜圖；f——蠕動泵進樣平均質譜圖圖2 不同采集方法(時間)所獲得的敵百蟲-D6質譜圖a——mass spectrum at 1.37 min by LC；b——mass spectrum at 1.47 min by LC；c——mass spectrum at 1.57 min by LC；d——mass spectrum at 1.67 min by LC；e——mass spectrum at 2.17 min by LC；f——mass spectrum by acquired by syringe pumpFig.2 Mass Spectrums of Trichlorfon-D6 acquired by different method or at different time

根據(jù)上述推測，在選用質譜數(shù)據(jù)點時，應優(yōu)先選用接近保留時間的數(shù)據(jù)點，而盡可能避免將靠近峰邊緣的數(shù)據(jù)點平均到結果中，以免引起較大誤差。圖3展示了同位素豐度結果與質譜數(shù)據(jù)選用點數(shù)的關系——當以保留時間為中心向左右均勻地增加所選質譜數(shù)據(jù)點的數(shù)量時，平均質譜圖所計算得到的同位素豐度結果隨之降低；當選用的點數(shù)達到19點時，測定結果與蠕動泵法得到的結果持平(98.75 atom%D)；當超過25點時，利用平均質譜圖所計算得到的豐度結果快速降低。因此，本文在用液相色譜替代蠕動泵引入樣品時，選擇以待測物保留時間為中心前后19張質譜圖進行疊加平均，并進行結果計算。

3.3 同位素豐度測定與樣品濃度的關系

采用液質聯(lián)用法測定0.001 g/L，0.01 g/L，0.1 g/L，1 g/L敵百蟲-D6同位素豐度的結果，每個樣品平行測定6次(表1)；采用蠕動泵引入相同的樣品，測定同位素豐度，每個樣品平行測定6次，每兩次間均采用甲醇清洗進樣針6次并用500 μL甲醇清洗進樣管路2次(表2)。結果表明，液質聯(lián)用法在方法精密度上有良好的表現(xiàn)，且在樣品濃度較高的時候(0.1 g/L及以上)時，測定結果與采用標準方法(蠕動泵引入樣品)得到的測定結果吻合得較好。

圖3 同位素豐度測定結果與質譜圖選取點數(shù)的關系Fig.3 The relationship between isotope enrichment and the number of average mass spectrums

而無論哪一種方法，隨著濃度降低，同位素豐度測定結果都會隨之下降；尤其是當?shù)陀谀骋粷舛葧r，測定結果將嚴重失真。這一現(xiàn)象印證了3.2中的推斷，即當樣品濃度降低時，m/z=257～262處質譜相對峰強的測定更易受到基質效應的影響，導致背景對這部分峰強度的貢獻增大，從而使同位素豐度的測定結果快速下降。因此，在測定同位素豐度時，至少應保證樣品溶液濃度，以免受到質譜背景的干擾。

表1 液質聯(lián)用法測定不同濃度敵百蟲-D6樣品同位素豐度的結果Table 1 Results of trichlorfon-D6 isotope enrichment in different concentrations determined by LC-MS method

表2 蠕動泵法測定不同濃度敵百蟲-D6樣品同位素豐度的結果Table 2 Results of trichlorfon-D6 isotope enrichment in different concentrations determined by syringe pump method

4 小結

通過數(shù)學推算，將“質量簇”法中解線性方程組的過程簡化為一個直接計算式，可大幅減少敵百蟲-D6生產質控過程中結果計算所需的時間；采用液相色譜代替質譜的蠕動泵引入樣品以加快樣品分析的速度，通過試驗及數(shù)據(jù)分析確定了質譜數(shù)據(jù)的選取范圍，保持了分析結果的準確性；本文首次就樣品濃度對同位素豐度測定結果的影響開展研究，明確了過低的樣品濃度不利于得到準確的分析結果。目前，采用有機質譜對同位素標記試劑進行同位素豐度測定的方法尚有較大研究空間，關于如何準確、精密地測定同位素豐度的研究以及相關技術標準的制定還需要積累大量數(shù)據(jù)，本文提出的敵百蟲-D6同位素豐度的快速測定和計算方法也可以推廣至其他同位素標記試劑豐度的測定。