邱 婷，張曙盛,2，朱蘇珍，郭寅龍

(1.中國科學院 上海有機化學研究所，上海 200032；2.上海中醫(yī)藥大學 創(chuàng)新中藥研究院，上海 201203)

甜蜜素，化學名環(huán)己基氨基磺酸鈉(sodium cyclamate)，是一種常用的人工合成甜味劑，于1937年被伊利諾伊大學的學生麥克爾·斯維達 (Michael Sveda) 發(fā)現(xiàn)。甜蜜素甜味純正，甜度能達到蔗糖的40～50倍，是一種非營養(yǎng)型甜味劑。由于其價格便宜，而且用量稍多也不會有苦味[1]，因而被廣泛應用于各類食品、調(diào)味品、化妝品中。從1986年我國衛(wèi)生部批準甜蜜素作為食品添加劑至今，甜蜜素在我國已使用了幾十年。但有研究指出甜蜜素在腸道細菌作用下能分解成有慢性毒性的環(huán)己胺[2]，可能有致癌、致畸、損害腎功能等副作用。因而包括美、英、日、韓、加拿大等在內(nèi)的40多個國家相繼禁止在本國使用甜蜜素作為食品添加劑。我國雖還未明文禁止使用甜蜜素，但由于其安全性一直受到質(zhì)疑，在中華人民共和國衛(wèi)生部發(fā)布的《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》(GB 2760—2014)中，就對人工甜蜜素的適用范圍和使用量進行了明確限定。為了規(guī)范甜蜜素的使用，需要一種能快速、準確的技術(shù)對其進行檢測。食品安全國家標準《食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測定》(GB 5009.97—2016)中規(guī)定了三種甜蜜素的分析檢測方法，分別為氣相色譜法、液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法。其中液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法因為具有靈敏度高、分離能力強等優(yōu)點，近年來在食品安全檢測領(lǐng)域的應用越來越多。但是，該方法需要克服復雜的食品樣品的基質(zhì)效應，樣品處理過程較為繁瑣。相比傳統(tǒng)的色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，穩(wěn)定同位素內(nèi)標試劑與同位素稀釋質(zhì)譜法結(jié)合的檢測技術(shù)能在保證高靈敏度的同時，還具有抗干擾能力強、快捷高效等優(yōu)點，因此有望成為一種很有前途的替代方法，不過同位素稀釋質(zhì)譜法需要相應的穩(wěn)定同位素內(nèi)標試劑配合使用[3-4]。因此穩(wěn)定同位素內(nèi)標試劑的合成無疑是這種檢測方法是否能使用的關(guān)鍵。

目前報道的同位素標記甜蜜素主要為放射性標記，如用35S和14C標記的甜蜜素研究甜蜜素在生物體內(nèi)的分布和代謝[5-7]，35S標記的甜蜜素用于同位素稀釋法定量測定甜蜜素[8]等，而穩(wěn)定同位素標記的甜蜜素則未見報道。而且，由于35S、14C具有放射性，它們的衰變過程中標記試劑的化學純度會不可避免地隨著時間的延長而越來越低。同時，目前由于放射性物質(zhì)需要具有相應資質(zhì)的單位和個人才能使用，因此其應用受到限制。為了解決這些問題，本研究開發(fā)了一種穩(wěn)定同位素氘標記的甜蜜素，其合成方法簡單成熟，原料廉價易得，得到氘代甜蜜素的氘同位素豐度大于99 %，可很好的作為內(nèi)標試劑用于甜蜜素的定性、定量分析。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

IKA RCT basic IKAMAG safety control型磁力攪拌器：艾卡(廣州)儀器設備有限公司； Heidolph Hei-VAP Precision型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：海道爾夫儀器設備(上海)有限公司；JULABO FL601型冷卻循環(huán)器：優(yōu)萊博技術(shù)(北京)有限公司；400MHz核磁共振譜儀：美國布魯克公司(Bruker)；Thermo Scientific TSQ Fortis三重四極桿質(zhì)譜儀：美國賽默飛世爾科技公司(Thermo Fisher)。

1.2 主要材料與試劑

重水(D2O)：2H同位素豐度≥99.8%，美國劍橋穩(wěn)定同位素公司(Cambridge Isotope Laboratories, Inc)；環(huán)己酮、鹽酸羥胺、無水乙酸鈉、鄰二氯苯、無水乙醚、氫氧化鈉、金屬鈉、無水硫酸鎂等試劑：均為市售分析純或化學純，購買后直接使用，未進一步純化，國藥集團上?；瘜W試劑公司。

1.3 實驗方法

同位素氘標記甜蜜素的合成路線示于圖1，以環(huán)己酮為原料，經(jīng)過H-D交換、還原胺化、磺?；?、堿中和成鹽等幾個關(guān)鍵步驟，得到2,2,6,6-四氘代環(huán)己基氨基磺酸鈉。

1.3.12,2,6,6-四氘代環(huán)己酮肟的合成 干燥的50 mL茄形瓶中加入20 mL重水、100 mg氫氧化鈉(或者50 mg金屬鈉)，溶解后再加入4.0 mL環(huán)己酮，裝上回流冷凝管，加熱至90 ℃并攪拌反應3 h進行氫-氘交換反應，冷卻到室溫后用無水乙醚萃取，收集有機相用無水硫酸鎂干燥，濃縮后得鄰位氘代環(huán)己酮；將得到的鄰位氘代環(huán)己酮再進行兩次氫-氘交換反應，最后得到四氘代環(huán)己酮與重水的混合液；向得到的四氘代環(huán)己酮與重水的混合液中加入6.0 g鹽酸羥胺、9.0 g無水乙酸鈉，加熱至70 ℃并攪拌反應10 min，冷卻到室溫后用乙醚萃取，有機相濃縮后柱層析得到2,2,6,6-四氘代環(huán)己酮肟3.5 g，收率為76%。

圖1 甜蜜素-D4的合成路線Fig.1 Protocols for the synthesis of sodium cyclamate-d4

1.3.22,2,6,6-四氘代環(huán)己胺的合成 250 mL的茄形瓶中依次加入3.0 g 2,2,6,6-四氘代環(huán)己酮肟，100 mL無水乙醚，冰水浴下攪拌，緩慢分批加入5.0 g氫化鋁鋰，加熱回流并攪拌反應，30 min后用冰水浴冷卻反應體系，緩慢滴加飽和硫酸鈉水溶液，使未反應的氫化鋁鋰剛好猝滅，無氣泡產(chǎn)生為止，反應體系用硅藻土過濾，濾餅用乙醚洗滌，濾液用無水硫酸鈉干燥，濃縮，得到2,2,6,6-四氘代環(huán)己胺2.3 g，收率為85%。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ1.05～1.31(m,3H),1.55～1.75(m,2H),2.03(s,2H),2.64(s,1H)。

1.3.32,2,6,6-四氘代環(huán)己基氨基磺酸鈉的合成 20 mL的封管中加入1.0 g氨基磺酸、2.0 g 2,2,6,6-四氘代環(huán)己胺、4.0 mL鄰二氯苯，加入一顆磁力攪拌子，密封后加熱至180 ℃并攪拌回流反應4小時，冷卻到室溫后加入10 mL 10%的氫氧化鈉溶液中和至pH值大于9，再加入10 mL石油醚，分去有機相，收集水相用活性炭脫色后，濃縮至4 mL左右，置于冰水浴中冷卻結(jié)晶，過濾，得到2,2,6,6-四氘代環(huán)己基氨基磺酸鈉1.9 g，收率為92%。高純度樣品可以使用熱水重結(jié)晶。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ1.01～1.21(m,3H),1.44～1.53(m,1H),1.56～1.64(m,2H),2.84(d,1H,J=6.02 Hz),3.79(d,1H,J=6.06 Hz)。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)物合成

穩(wěn)定同位素氘標記的環(huán)己胺的同位素豐度直接決定了最終合成的氘標記甜蜜素的同位素豐度，因此本研究首先優(yōu)化了氘代環(huán)己胺的合成方法。Gordon等使用氘代氫化鋁鋰還原環(huán)己酮肟，得到一氘代環(huán)己胺[9-10]。本研究選擇環(huán)己酮還原胺化的方法合成環(huán)己胺，在堿性條件下使用重水與環(huán)己酮發(fā)生氫-氘交換反應，得到羰基鄰位四氘代環(huán)己酮，再與鹽酸羥胺縮合得到四氘代環(huán)己酮肟，再使用氫化鋁鋰還原得到四氘代環(huán)己胺。在反應過程中，使用的是同位素豐度99.8%的重水，加入氫氧化鈉催化環(huán)己酮羰基的烯醇化，實現(xiàn)了羰基鄰位的氫-氘交換。同時，為了保證得到同位素豐度足夠高的氘代環(huán)己胺，連續(xù)進行了三次環(huán)己酮的氫-氘交換反應(圖2)，來確保環(huán)己酮鄰位氘的同位素豐度大于99%。在合成四氘代環(huán)己酮肟時，由于四氘代環(huán)己酮價格昂貴，為了保證四氘代環(huán)己酮的高轉(zhuǎn)化率，本方法使用了過量鹽酸羥胺。同樣的，在還原四氘代環(huán)己酮肟時也使用了過量的還原劑氫化鋁鋰，最終以65%的總收率得到2,2,6,6-四氘代環(huán)己胺。

圖2 環(huán)己酮的氫-氘交換反應Fig.2 Hydrogen-Deuterium exchange reaction of cyclohexone

環(huán)己基氨基磺酸鈉(甜蜜素)的常用合成方法示于圖3，一般以環(huán)己胺為原料，使用氨基磺酸、氯磺酸、三氧化硫-三甲胺復合物等不同的磺化試劑進行磺化反應[11-16]，再堿化結(jié)晶得到環(huán)己基氨基磺酸鈉。綜合考慮原料的易得性、腐蝕性和毒性，本研究選擇氨基磺酸為磺化試劑。同時，參考楊輝榮[14]等的工作，以鄰二氯苯為溶劑，環(huán)己胺和氨基磺酸的當量比為1∶2，在160 ℃下反應3 h，可以得到環(huán)己基氨基磺酸鈉。經(jīng)過嘗試，發(fā)現(xiàn)適當升高溫度和延長反應時間，有利于提高收率。由于環(huán)己胺的沸點為134 ℃，鄰二氯苯的沸點為179 ℃，為了防止氘代環(huán)己胺逸出反應體系，選擇以封管為容器進行反應，在180 ℃下進行4 h，最終以92%的收率得到氨基磺酸。

圖3 甜蜜素的常見合成方法Fig.3 The common method for the synthesis of sodium cyclamate

2.2 產(chǎn)物表征

關(guān)鍵中間體2,2,6,6-四氘代環(huán)己胺的核磁譜圖示于圖4，δ2.64為氨基α位氫的核磁信號，δ2.03為氨基氫的核磁信號，因與水的信號重疊，積分大于2，δ1.00～1.72之間的為環(huán)己烷3,4,5位6個氫的核磁信號。

產(chǎn)物2,2,6,6-四氘代環(huán)己基氨基磺酸鈉的核磁譜圖示于圖5，δ3.79為磺酰胺N-H的核磁信號，δ2.84為環(huán)己基1位氫的核磁信號，δ1.02～1.62之間的為環(huán)己烷3,4,5位6個氫的核磁信號。

圖4 2,2,6,6-四氘代環(huán)己胺的1H NMR譜圖Fig.4 1H NMR spectra of 2,2,6,6-tetradeuterium cyclohexylamine

圖5 2,2,6,6-四氘代環(huán)己基氨基磺酸鈉的1H NMR譜圖Fig.5 1H NMR spectra of sodium 2,2,6,6-tetradeuterium cyclohexyl sulfamate

采用負離子模式分析產(chǎn)物2,2,6,6-四氘代環(huán)己基氨基磺酸鈉的串聯(lián)質(zhì)譜行為。m/z182為2,2,6,6-四氘代環(huán)己基氨基磺酸根負離子[M-Na]-，二級譜圖可以看到裂解后主要得到m/z80的子離子[SO3]·-，還有少量m/z97的子離子[HDNSO3]-。其質(zhì)譜譜圖和裂解模式示于圖6。

圖6 2,2,6,6-四氘代環(huán)己基氨基磺酸鈉的MS/MS譜圖和裂解模式Fig.6 MS/MS spectra and fragmentation pattern of sodium 2,2,6,6-tetradeuterium cyclohexyl sulfamate

3 結(jié)論

本文以環(huán)己酮為原料，以便宜易得的重水為穩(wěn)定同位素標記源，經(jīng)過氫-氘交換，還原胺化，磺酰化等關(guān)鍵步驟，合成了2,2,6,6-四氘代環(huán)己基氨基磺酸鈉。采用多次氫-氘交換的同位素標記策略，保障產(chǎn)物中氘的同位素豐度不低于99%，能很好的作為內(nèi)標試劑用于甜蜜素的定性定量分析或者示蹤劑用于科學研究。