陳燕秋，侯 捷，雷 雯，李良君，徐仲杰，高慧敏

(上?；ぱ芯吭河邢薰?國家同位素工程技術(shù)研究中心上海分中心上海穩(wěn)定性同位素工程技術(shù)研究中心，上海 200062)

穩(wěn)定同位素13C標記的葡萄糖作為安全、方便、有效的示蹤工具，被廣泛應(yīng)用于代謝研究[1-4]、疾病診斷[5-7]、分析檢測[8-9]以及有機合成[10-12]中。代謝組學是目前關(guān)注度頗高的組學方向。在代謝組學[13-16]中，13C葡萄糖作為最常用示蹤劑，通過將其引入生物體或細胞內(nèi)，測定不同部位或不同時間內(nèi)代謝產(chǎn)物的含量以及對比13C葡萄糖產(chǎn)物的同位素豐度變化情況，以此研究特定代謝循環(huán)中目標化合物的代謝規(guī)律。Gay[17]等通過給健康女性進食不同13C豐度的食物若干天，以13C標記的葡萄糖的檢測結(jié)果進行研究肝糖原的代謝動力學以及糖原新生；臨床上采用13C標記的葡萄糖通過呼氣試驗[18]對糖尿病患者進行診斷；Riddell[19]通過青少年對攝入13C標記葡萄糖的體內(nèi)代謝追蹤結(jié)果，以此研究青少年鍛煉期間內(nèi)食物的代謝通路；楊子昂[20]采用分別給高代謝膿毒癥新西蘭兔和對照新西蘭兔注射13C標記的葡萄糖，成功建立了高代謝膿毒癥兔模型。在13C葡萄糖示蹤代謝實驗中，13C葡萄糖的同位素豐度是衡量示蹤劑的關(guān)鍵指標，同時，精確檢測代謝物的同位素豐度, 是進行代謝流分析的前提條件。目前，對于13C葡萄糖的同位素豐度檢測方法鮮有報道。本文對比了MSTFA和MBTFA兩種衍生化試劑對葡萄糖的衍生化效果，著重研究葡萄糖的酰化條件，并對輔助溶劑、衍生溫度以及衍生時間等影響衍生化效果的條件進行了優(yōu)化；采用選擇離子檢測模式(SIM)對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行采集，建立氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定13C標記葡萄糖同位素豐度的方法，并對該方法進行驗證。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS/MS)：7890B-7000C，美國Agilent公司；HP-5 MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)：美國Agilent公司；電子天平：瑞士梅特勒-托利多集團，精度0.01 mg；真空干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；超純水系統(tǒng)：美國Merck Millipore公司。

衍生化試劑：N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(MSTFA)、N-甲基二(三氟乙酰胺)(MBTFA)：美國Regis Technologies公司；天然豐度的葡萄糖標準品：CNW公司，純度99%；13C標記的葡萄糖：CIL公司，99 atom%13C；甲醇：HPLC級，Scharlab公司；吡啶：分析純，上海凌峰化學試劑有限公司；乙酸乙酯、甲苯、乙腈：分析純，CNW公司。

1.2 實驗方法

1.2.1葡萄糖標準溶液的配制 分別用1/100 000電子天平準確稱取10 mg的天然豐度葡萄糖標準品以及13C標記葡萄糖，加5 mL超純水完全溶解后定容于100 mL容量瓶中，混勻配制成濃度為0.1 g/L的標準儲存液。將標準儲存液稀釋成10 mg/L，進一步稀釋成0.1 mg/L的標準溶液備用。

1.2.2葡萄糖酰化反應(yīng)-輔助有機溶劑的優(yōu)化 選擇?；苌磻?yīng)中4種最常用的輔助溶劑進行葡萄糖衍生的優(yōu)化，取4份50 μL 10 mg/L的標準溶液于30 ℃真空干燥2 h，分別加入50 μL的輔助溶劑甲苯、乙腈、吡啶和乙酸乙酯，再加入50 μL的MBTFA于70 ℃下反應(yīng)1 h，待GC-MS分析。

1.2.3葡萄糖?；磻?yīng)-衍生化溫度及時間的優(yōu)化 各取12份50 μL 10 mg/L的標準溶液于30 ℃真空干燥2 h，依次加入50 μL的乙酸乙酯和50 μL的MBTFA，分別在60 ℃、70 ℃和80 ℃的溫度下，反應(yīng)30、60、90、120 min，待GC-MS分析。

1.2.4葡萄糖的兩種不同衍生化產(chǎn)物的對比 各取50 μL 10 mg/L的標準溶液于30 ℃真空干燥2 h。1) 硅烷化反應(yīng)[21]。采用N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(MSTFA)衍生，依次加入50 μL的吡啶和50 μL的MSTFA，80 ℃下反應(yīng)1 h，待GC-MS分析；2) ?；磻?yīng)。采用N-甲基二(三氟乙酰胺)(MBTFA)衍生，依次加入50 μL的乙酸乙酯和50 μL的MBTFA，70 ℃下反應(yīng)1 h，待GC-MS分析。1.2.2、1.2.3和1.2.4均利用全掃描模式(Scan)對產(chǎn)物進行檢測，以衍生后產(chǎn)物的峰面積作為衡量衍生化效果的指標。

1.2.5采集模式的選擇 分別取50 μL不同濃度0.1 mg/L、10 mg/L以及0.1 g/L的13C標記的葡萄糖溶液，于30℃真空干燥2 h，依次加入50 μL的乙酸乙酯和50 μL的MBTFA，70 ℃反應(yīng)1 h，在全掃描模式和離子掃描模式下連續(xù)8次進樣。

1.2.6實驗條件 1) 色譜條件。色譜柱：Agilent HP-5 MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣He氣(純度99.999%)，流速1.0 mL/min；進樣口溫度280 ℃；2) 升溫程序。以5 ℃/min由80 ℃升至110 ℃，然后以10 ℃/min升至150 ℃，以5 ℃/min升至170 ℃，最后以10 ℃/min升至250 ℃；進樣量1 μL；不分流。3) 質(zhì)譜分析條件。電子轟擊離子源(EI)，電離能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；接口溫度300 ℃。全掃描模式(Scan)：電離能量70 eV，掃描范圍m/z540～560；根據(jù)全掃描的質(zhì)譜圖確定離子掃描模式(SIM)的質(zhì)譜條件：電離能量70 eV，掃描離子m/z547、m/z548、m/z549、m/z550、m/z551、m/z552以及m/z553。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖酰化條件優(yōu)化

用于糖類化合物的衍生化試劑，通常采用?；噭┖凸柰榛噭Ｆ咸烟墙?jīng)過硅烷化或者?；磻?yīng)后，可降低葡萄糖的沸點，使其具有更好的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性。葡萄糖經(jīng)硅烷化試劑衍生后葡萄糖分子中的活潑氫被三甲基硅烷(TMS)所取代(詳見圖1)；葡萄糖經(jīng)?；噭┭苌笃咸烟欠肿又械幕顫姎浔货；〈?，反應(yīng)示于圖2。

樣品衍生化過程中，輔助溶劑的選擇、衍生化時間的控制、以及衍生化溫度的確定至關(guān)重要。采用硅烷化衍生的文獻報道較多，參考文獻[21]對葡萄糖進行硅烷衍生化，本文將著重優(yōu)化葡萄糖酰化條件。

2.1.1輔助有機溶劑優(yōu)化 輔助有機溶劑對衍生化效果有一定影響，葡萄糖中的某些結(jié)構(gòu)會與輔助溶劑進行配合，從而影響衍生化反應(yīng)的速率。以MBTFA為衍生化試劑，四種有機溶劑甲苯、乙腈、吡啶和乙酸乙酯分別作為衍生化反應(yīng)時的輔助溶劑，來探究在衍生的?；^程中輔助溶劑對13C葡萄糖的衍生化效果的影響，GC-MS分析結(jié)果示于圖3。為了直觀比較輔助溶劑對衍生化效果的影響，以輔助溶劑的種類為橫坐標，GC-MS峰面積為縱坐標作圖，峰面積大即表明該輔助溶劑的效果好。結(jié)果表明，當利用MBTFA對葡萄糖進行?；苌鷷r，乙酸乙酯作為輔助溶劑時的衍生化效果最好。

圖1 葡萄糖與MSTFA的衍生反應(yīng)Fig.1 Derivative reaction of glucose with MSTFA

圖2 葡萄糖與MBTFA的衍生反應(yīng)Fig.2 Derivative reaction of glucose with MBTFA

圖3 不同輔助溶劑對目標葡萄糖衍生化效果的影響Fig.3 Effects of different auxiliary solvents on the target glucose derivatization efficiency

2.1.2衍生化溫度及時間的優(yōu)化 在優(yōu)化衍生溫度以及衍生時間時，采用乙酸乙酯作為衍生過程中的輔助溶劑。1.2.3實驗中，分別考查了在60、70、80 ℃條件下，對比葡萄糖分別衍生30、60、90、120 min時的衍生效果，以此確定最優(yōu)的衍生化溫度及衍生時間，結(jié)果示于圖4。結(jié)果表明，隨著溫度的升高，衍生化速度越快。但在80 ℃時，乙酸乙酯揮發(fā)嚴重且與70 ℃下衍生效果相差不大。因此，確定衍生化溫度為70 ℃，衍生時間為60 min。

2.2 兩種衍生化產(chǎn)物的色譜行為比較

分別采用MSTFA和MBTFA對相同濃度的13C標記葡萄糖進行衍生，總離子流圖示于圖5。

圖4 衍生溫度及時間對目標葡萄糖衍生化效果的影響Fig.4 Effect of derivatization temperature and time on target glucose derivatization efficiency

對兩種不同衍生化試劑的實驗組1.2.4分別設(shè)置六組相同濃度的平行實驗。比較圖5a、圖5b及表1的峰面積數(shù)據(jù)可知，三氟乙?；a(chǎn)物響應(yīng)要高于硅烷化產(chǎn)物，且衍生產(chǎn)物更為穩(wěn)定。因此，以MBTFA作為衍生化試劑衍生效果更好。

2.3 葡萄糖-13C6同位素豐度檢測模式優(yōu)化

全掃描模式(Scan)時質(zhì)譜最常用的掃描方式，由于Scan模式可以采集到化合物的完整的碎片信息，在化合物定性方面具有較大優(yōu)勢。采用全掃描模式檢測時，得到離子總量多，基線噪聲大。離子掃描模式(SIM)可以較好地消除雜質(zhì)干擾，檢測靈敏度比全掃描模式提高了數(shù)倍。根據(jù)全掃描的質(zhì)譜圖確定離子掃描模式的質(zhì)譜條件：電離能量70 eV，掃描離子m/z547、m/z548、m/z549、m/z550、m/z551、m/z552以及m/z553。

本實驗用兩種不同的采集模式探究其對檢測結(jié)果的影響。采用MBTFA衍生化試劑，在2.1節(jié)優(yōu)化的條件下，分別對13C葡萄糖和天然葡萄糖進行衍生。根據(jù)1.2.5實驗條件，并采用文獻[22]中的“質(zhì)量簇”方法進行同位素豐度計算，結(jié)果列于表2。結(jié)果表明，較高濃度時(大于10 mg/L)，兩種采集模式的檢測結(jié)果較為接近，且兩種采集模式的下方法精密度均小于0.4%，相對偏差小于0.4%；在濃度較低時(0.1 mg/L)，兩種采集模式的檢測結(jié)果差異較為明顯。

圖5 13C標記葡萄糖MSTFA衍生物(a)與MBTFA衍生化物(b)的TIC圖譜Fig.5 TIC map of 13C-labeled glucose derivatized with MSTFA (a) 13C-labeled glucose derivatized with MBTFA (b)

表1 MSTFA和MBTFA衍生化后13C標記葡萄糖檢測結(jié)果的峰面積Table 1 Peak area of 13C-labeled glucose detection results after derivatization with MSTFA and MBTFA

當13C標記葡萄糖處于低濃度水平時，兩種采集模式檢測結(jié)果偏差較大，檢測結(jié)果偏差接近1%。這是由于四極桿質(zhì)譜分辨率有限，導致全掃描模式(Scan)在低濃度下，無法完全分離開，如圖6所示。離子掃描模式(SIM)對于含量低的物質(zhì)，檢出限、靈敏度均比全掃描模式(Scan)高出2～3個數(shù)量級。在檢測過程中靈敏的高低直接影響同位素豐度測定的結(jié)果。化合物濃度低時，Scan模式由于基線提高導致目標物的信噪比明顯降低，而SIM模式下只對包含標記位點特征離子碎片的同位素峰進行掃描，可以顯著降低背景干擾，提高檢測靈敏度及選擇性。此外，質(zhì)譜測到的同位素分布并非一個確定值，而是隨著保留時間和總離子流強度而變化的，在峰的前沿、峰的中部和峰的拖尾處，得到的同位素分布不同，因此采用Scan模式進行同位素豐度檢測時，會造成較大的偏差。此外，理論上樣品的濃度并不影響化合物的同位素豐度，但在儀器背景的干擾下，會導致在低濃度時同位素豐度檢測結(jié)果與理論值相差較大。為確保檢測結(jié)果的準確性，本文所建立的酰化試劑衍生葡萄糖同位素豐度檢測方法的檢出限為0.1 mg/L，在此濃度下，方法相對標準偏差小于0.4%。

表2 兩種采集模式對不同濃度13C標記葡萄糖豐度結(jié)果的影響Table 2 The effect of two collection modes at different concentrations on 13C-labeled glucose abundance results

圖6 天然豐度葡萄糖(a)和13C標記葡萄糖(b)EI輪廓圖Fig.6 Electron impact (El) profile of natural abundance glucose (a) and high abundance 13C labeling glucose (b)

3 小結(jié)

本文優(yōu)化了衍生過程中輔助有機溶劑的類型以及衍生化的溫度和時間，并通過不同衍生化試劑的選擇，建立了基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定13C標記葡萄糖的豐度的方法。利用“質(zhì)量簇”計算相關(guān)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，建立的13C標記葡萄糖檢測方法的計算值與理論值基本相符，方法精密度優(yōu)于0.2%，絕對偏差小于0.3%。隨著代謝流的不斷發(fā)展，13C標記葡萄糖作為重要示蹤工具，其豐度準確檢測至關(guān)重要。該方法可提供13C標記葡萄糖同位素豐度檢測方法，對同位素標記試劑的檢測具有重要意義，為13C標記葡萄糖示蹤劑的質(zhì)量控制提供技術(shù)支持。