徐蒙 崔青 李順樂(lè) 馬建倉(cāng) 陳熹 任一凡

1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院普外科，西安 710004；2西安市中心醫(yī)院心內(nèi)科，西安 710003

AP的發(fā)病常伴隨著線粒體功能的紊亂，而線粒體功能紊亂可導(dǎo)致多種組織器官功能異常[1-2]。以往研究證實(shí)，減輕線粒體功能的損傷可以有效地緩解肝臟缺血再灌注損傷的程度[3]。施他寧是一種有效緩解急性胰腺炎癥狀的生長(zhǎng)抑素，因顯著的治療效果而被廣泛地應(yīng)用于臨床，但其對(duì)胰腺腺泡細(xì)胞的作用機(jī)制仍未可知。本研究旨在探討施他寧對(duì)AP相關(guān)胰腺腺泡細(xì)胞線粒體損傷的影響，為闡明施他寧的藥理機(jī)制提供新的思路。

材料與方法

一、動(dòng)物模型建立及分組

24只雄性C57BL/6小鼠(體重18～22 g)購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境。將24只小鼠按數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組、AP組及AP+施他寧治療組(施他寧組)，每組8只。實(shí)驗(yàn)程序均符合國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南，并獲得西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

所有小鼠在實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，自由飲水。AP組采用腹腔注射20%左旋精氨酸(4.0 g/kg，美國(guó)Sigma公司)，1 h后再次注射相同劑量左旋精氨酸的方法制備AP模型；施他寧組在制模后2 h腹腔注射0.4 mg/kg施他寧(瑞士Serono公司)；對(duì)照組小鼠腹腔注射等容積生理鹽水。首次精氨酸注射后72 h處死小鼠，眼眶取血，剖腹取胰腺。

二、觀察指標(biāo)

1．胰腺組織病理學(xué)檢查：胰腺組織常規(guī)固定、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察胰腺組織的損傷程度，并根據(jù)水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、出血和壞死程度進(jìn)行進(jìn)行病理評(píng)分[4]。

2．血清淀粉酶和脂肪酶檢測(cè)：應(yīng)用血清淀粉酶和脂肪酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組小鼠血清淀粉酶和脂肪酶的水平。試劑盒均購(gòu)自南京建成生物科技有限公司，具體操作方法參照說(shuō)明書。

3．血清IL-6、IL-10、TNF-α水平檢測(cè)：采用ELISA法檢測(cè)血清IL-6、IL-10、TNF-α水平。試劑盒均購(gòu)自武漢云克隆公司，檢測(cè)步驟參照說(shuō)明書。

4．胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)線粒體檢測(cè)：采用Mitotracker紅色熒光標(biāo)記法觀察線粒體的損傷情況。胰腺組織做冰凍切片，應(yīng)用Mitotracker染料進(jìn)行染色。胰腺腺泡細(xì)胞的線粒體會(huì)被Mitotracker染料標(biāo)記為紅色，損傷加重的線粒體熒光強(qiáng)度會(huì)減弱。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，每張切片400倍下隨機(jī)拍3張視野，并用imageJ Pro軟件對(duì)各組熒光照片定量。

5．胰腺組織ND-3蛋白表達(dá)量檢測(cè)：采用常規(guī)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)ND-3蛋白表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參。兔抗鼠ND-3一抗購(gòu)自美國(guó)ABCAM公司，工作濃度1∶1 000，羊抗兔IgG-HRP二抗購(gòu)自中國(guó)碧云天公司，工作濃度1∶5 000。最后ECL發(fā)光，X片曝光顯影、定影。應(yīng)用凝膠成像儀掃描蛋白條帶，并用儀器自帶的Image J軟件進(jìn)行條帶灰度的定量分析，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

6．胰腺組織線粒體融合蛋白2(mitofusion2，Mfn2)和線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A, TFAM)蛋白檢測(cè)：采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)胰腺組織Mfn-2、TFAM蛋白表達(dá)量。兔抗鼠Mfn2單克隆抗體(美國(guó)CST公司)工作濃度1∶1 000，兔抗鼠TFAM抗體(美國(guó)ABCAM公司)工作濃度1∶1 000，二抗1∶5 000。光鏡下觀察3處不同的視野，深棕色染色區(qū)域?yàn)榈鞍钻?yáng)性表達(dá)區(qū)域，應(yīng)用Image J pro軟件對(duì)陽(yáng)性面積進(jìn)行定量。

7．胰腺組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)水平檢測(cè)：用組織破碎儀制備胰腺組織勻漿，采用SOD、GSH試劑盒檢測(cè)SOD、GSH活性；采用脂質(zhì)過(guò)氧化工具包檢測(cè)MDA水平。試劑盒均購(gòu)自南京建成生物科技有限公司，按說(shuō)明書操作。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、施他寧減輕AP小鼠胰腺組織損傷

對(duì)照組小鼠胰腺組織無(wú)明顯病理改變；AP組小鼠胰腺組織明顯水腫、出血和壞死；施他寧組胰腺組織水腫、出血和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度較AP組明顯減輕，壞死面積明顯減少(圖1)。對(duì)照組、AP組、施他寧組小鼠胰腺病理評(píng)分分別為(0.47±0.31)、(3.93±0.64)、(2.07±0.50)分，AP組顯著高于對(duì)照組，施他寧組顯著低于AP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，表明施他寧可以有效地減輕AP胰腺的損傷程度。

對(duì)照組、AP組、施他寧組小鼠血清淀粉酶水平分別為(1 094±250)、(1 832±86)、(1 493±172)U/L；脂肪酶水平分別為(237.0±96.8)、(671.0±164.5)、(225.4±83.2)U/L，AP組顯著高于對(duì)照組，施他寧組顯著低于AP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，表明施他寧能有效地減少胰腺腺泡細(xì)胞的壞死。

二、施他寧緩解AP小鼠的全身炎癥反應(yīng)

對(duì)照組、AP組、施他寧組小鼠血清IL-6水平分別為(55.88±13.53)、(358.60±139.22)、(99.09±36.65)ng/L；TNF-α分別為(20.39±4.56)、(40.83±1.62)、(22.75±11.24)ng/L；IL-10分別為(17.48±7.05)、(9.92±8.73)、(15.12±5.03)ng/L。AP組IL-6、TNF-α水平顯著高于對(duì)照組，施他寧組顯著低于AP組；AP組的IL-10水平顯著低于對(duì)照組，施他寧組顯著高于AP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，提示施他寧可以有效地抑制促炎因子，升高抑炎因子，從而減輕炎癥反應(yīng)。

三、施他寧減輕AP小鼠胰腺細(xì)胞線粒體的損傷

對(duì)照組、AP組、施他寧組小鼠胰腺組織Mitotracker相對(duì)熒光密度分別為107.67±17.62、40.00±10.15、71.67±17.62(圖2)，AP組小鼠胰腺細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量較對(duì)照組減少約60%，而施他寧較AP組的線粒體數(shù)量增加約40%。代表線粒體數(shù)量的ND-3蛋白在對(duì)照組、AP組、施他寧組小鼠胰腺組織的表達(dá)量分別為1.02±0.12、0.11±0.05、0.45±0.16，AP組ND-3蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，施他寧組顯著高于AP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，提示施他寧可以增加AP時(shí)胰腺腺泡細(xì)胞的線粒體數(shù)量。

圖2 對(duì)照組(1)、AP組(2)、施他寧組(3)小鼠胰腺腺泡細(xì)胞線粒體數(shù)量(2A～2C：Mitrotracker染色；2D～2F：細(xì)胞核；2G～2I：融合圖)

四、施他寧保護(hù)AP小鼠胰腺細(xì)胞線粒體的功能

對(duì)照組、AP組、施他寧組小鼠胰腺組織TFAM表達(dá)量分別為100%、54%、78%；Mfn-2蛋白表達(dá)量分別為100%、47%、86%(圖3)，AP組較對(duì)照組顯著減少，施他寧組較AP顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，提示AP時(shí)胰腺腺泡細(xì)胞線粒體發(fā)生和融合的功能受損，施他寧可以有效增加TFAM和Mfn-2蛋白的表達(dá)。

五、施他寧緩解AP小鼠胰腺組織氧化應(yīng)激反應(yīng)

對(duì)照組、AP組、施他寧組小鼠胰腺組織MDA分別為(2.90±0.17)、(7.33±2.08)、(5.00±1.73)nmol/mg蛋白；SOD水平分別為(21.33±4.04)、(8.67±2.07)、(17.33±3.21)U/mg蛋白；GSH分別為(143.33±12.01)、(77.33±29.69)、(131.33±20.55)U/mg蛋白。AP組MDA顯著高于對(duì)照組，施他寧組顯著低于AP組；AP組SOD、GSH顯著低于對(duì)照組，施他寧組顯著高于AP 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，提示施他寧有效緩解了AP時(shí)胰腺組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

圖3 對(duì)照組、AP組、施他寧組小鼠胰腺腺組織Mfn-2(3A～3C)和TFAM(3D～3F)蛋白表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色)

討 論

AP發(fā)生時(shí)，胰腺組織局部的損傷壞死所造成的腺泡細(xì)胞內(nèi)容物外漏可以引起炎癥遞質(zhì)釋放，不斷加劇的胰腺組織損傷引起炎癥遞質(zhì)大量激活并釋放入血可以引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征[5]，造成多個(gè)遠(yuǎn)隔器官損傷并最終導(dǎo)致患者死亡[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，施他寧不僅可以緩解AP小鼠胰腺組織炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，更可以下調(diào)血清中IL-6、TNF-α等炎癥遞質(zhì)的水平從而減輕全身炎癥反應(yīng)，促進(jìn)AP病情的局限以及轉(zhuǎn)歸。線粒體損傷在AP的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色[7]。Mukherjee等[8]最近的一項(xiàng)研究表明，在左旋精氨酸誘導(dǎo)的AP中，高淀粉酶血癥、胰蛋白酶原激活、壞死、空泡化和炎癥都是因線粒體功能障礙介導(dǎo)的線粒體損傷所造成的。正常的線粒體功能離不開(kāi)線粒體正確的發(fā)生以及穩(wěn)定的融合[3]，TFAM蛋白和Mfn-2蛋白分別代表了線粒體發(fā)生以及線粒體融合水平，線粒體損傷不僅造成線粒體數(shù)目的減少，同樣造成線粒體功能的改變[1]。

本課題組前期的研究已經(jīng)證實(shí)，線粒體數(shù)目和功能的損傷在AP的發(fā)病進(jìn)程中處于核心位置，線粒體功能受損可以引起細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，施他寧不僅可以保護(hù)胰腺腺泡細(xì)胞線粒體的數(shù)目，并且可以恢復(fù)降低的Mfn-2以及TFAM蛋白的水平，這說(shuō)明施他寧可以在保護(hù)線粒體數(shù)目的同時(shí)，避免線粒體發(fā)生和融合的功能受到損害。在AP小鼠模型中，線粒體功能障礙可能是由鈣超載或非鈣超載機(jī)制引起的[8]。左旋精氨酸通過(guò)抑制F-ATP合酶的活性，即非鈣超載途徑誘導(dǎo)AP的發(fā)生[9]。本研究結(jié)果證實(shí)施他寧在非鈣依賴AP小鼠模型中是有益的，這表明它有可能用于治療非鈣離子超載導(dǎo)致的AP的患者。

線粒體損傷不僅可以造成胰腺腺泡細(xì)胞能量供應(yīng)障礙，也可以進(jìn)一步地引起細(xì)胞氧化應(yīng)激以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[10]，氧化應(yīng)激的持續(xù)存在可以反過(guò)來(lái)加重線粒體功能的紊亂，加速胰腺腺泡細(xì)胞的損傷和壞死[11]。線粒體功能紊亂所造成的能量失衡，伴隨細(xì)胞過(guò)氧化造成的細(xì)胞器損傷，可以引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)多種功能蛋白的錯(cuò)誤折疊和組合，進(jìn)一步加重胰腺腺泡細(xì)胞功能的喪失。嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激還可以誘發(fā)凋亡相關(guān)蛋白CHOP的表達(dá)升高，介導(dǎo)活化下游的Caspase 3以及BAX等凋亡相關(guān)基因，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[7,12]。本研究結(jié)果顯示施他寧同時(shí)可以緩解AP小鼠胰腺組織的氧化應(yīng)激水平，更進(jìn)一步減輕了AP小鼠胰腺腺泡細(xì)胞的損傷程度，緩解了AP病情。

綜上所述，施他寧可以緩解AP小鼠胰腺腺泡細(xì)胞中線粒體功能以及數(shù)目的損傷和減少，進(jìn)而減輕胰腺組織氧化應(yīng)激的水平，并最終保護(hù)受損的胰腺組織，改善全身炎癥反應(yīng)的情況。但是施他寧改善胰腺腺泡細(xì)胞線粒體功能的具體作用靶點(diǎn)目前尚未可知，本課題組將更進(jìn)一步地探索施他寧保護(hù)線粒體功能的具體分子機(jī)制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突