孫露陽,張歡妍,于雪冰,彭俊華,周紅

(1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江212013;2.江蘇大學(xué)附屬金壇醫(yī)院a.檢驗科，b.內(nèi)分泌科，江蘇常州213200)

中藥及其提取物(如小檗堿)可通過降低單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和IL-6的分泌，緩解2型糖尿病(type 2 diabetic mellitus，T2DM)的進程[1]。T2DM主要表現(xiàn)為葡萄糖(Glu)和糖化血紅蛋白(GHb)升高，出現(xiàn)胰島素耐受(insulin resistance, IR)，臨床上多使用胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment insulin ratio，HOMA-IR)評價IR。近年來HOMA-IR的cut-off值在新發(fā)T2DM及T2DM前期的探討亦較多[2]。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-221與胰島素受體信號通路IKK/PKC激活相關(guān)，在肥胖與T2DM進展過程中起重要的作用[3]。有學(xué)者在肥胖患者的脂肪間充間質(zhì)干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)TNF-α水平升高可降低miR-221的表達(dá)[4]。中醫(yī)認(rèn)為肥胖者脾虛濕盛、致胰島素耐受，參苓白術(shù)散有健脾、滲濕的作用，在脾虛濕困癥T2DM患者中顯示較好的療效[5]。然而，目前尚不清楚參苓白術(shù)散是否可以通過調(diào)節(jié)miR-221表達(dá)而影響炎癥因子水平，以緩解IR。本研究采用參苓白術(shù)散聯(lián)合二甲雙胍治療肥胖型T2DM患者，并檢測miR-221、炎癥因子(MCP-1、TNF-α)及HOMA-IR、GHb的表達(dá)水平變化，以期為中西醫(yī)聯(lián)合治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集2018年8月至2019年10月常州市金壇區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科就診的T2DM肥胖患者86例，男48例，女38例，年齡41～85歲，中位年齡26.5歲。均按照《中國2型糖尿病防治指南(2017年版)》明確診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：體質(zhì)指數(shù)(body mass index,BMI)≥25.0，空腹血糖≥7.0 mmol/L或隨機血糖≥11.1 mmol/L，患者有糖尿病的臨床癥狀。排除標(biāo)準(zhǔn)：除外心功能受損、腎功能及肝功能受損、腫瘤、結(jié)核、外傷或手術(shù)、急性感染性疾病者、自身免疫病、空腹血糖≤15.0 mmol/L或GHb≤11.0%、對二甲雙胍及參苓白術(shù)散過敏者、治療依從性差者。研究對象隨機分為實驗組和對照組，2組年齡、性別、BMI間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。治療方案：對照組為二甲雙胍(國藥準(zhǔn)字號H20054786，常州制藥廠公司)治療，口服0.5 g/次、3次/d。實驗組為參苓白術(shù)散(國藥準(zhǔn)字號Z11020755，北京同仁堂股份公司同仁堂制藥廠)聯(lián)合二甲雙胍(同對照組)治療，參苓白術(shù)散口服為6 g/次、3次/d。治療持續(xù)6個月。本研究通過金壇區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)(No. KY-2018-001)，入選對象均知情同意。

表1 各研究對象的臨床資料

1.2儀器與試劑 7500實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，AU5800生化分析儀和DX800I化學(xué)發(fā)光儀、640型紫外分光光度計(美國貝克曼庫爾特公司)，D-10糖化血紅蛋白分析儀和D-10糖化血紅蛋白分析試劑包(美國Bio-Rad公司)，Uranus全自動酶免工作站(深圳愛康公司)。TaqMan miRNA提取試劑盒(中國香港Ambion公司)，miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(德國Qiagen公司)，血清TNF-α和MCP-1檢測試劑盒(深圳欣博盛公司)，胰島素、C肽和Glu測定試劑盒及配套質(zhì)控品(美國貝克曼庫爾特公司)。

1.3標(biāo)本采集 于入組的實驗對象治療前、治療1周、治療3個月、治療6個月時,分別采集空腹靜脈血8 mL，其中1管用EDTA-K2抗凝管采集2.0 mL，另外2管用真空干燥管各采集3.0 mL，4 000 r/min離心10 min，分離血清，置于-80 ℃保存。

1.4血清生化指標(biāo)的檢測 采用己糖激酶法，按照Glu測定試劑盒及AU5800生化分析儀說明書檢測Glu；采用化學(xué)發(fā)光法，按照DX800I化學(xué)發(fā)光儀及其配套胰島素測定試劑盒和C肽試劑盒說明書檢測C肽的水平。采用高效液相色譜法(high efficiency liquid chromatography, HPLC)，按照D-10糖化血紅蛋白分析儀及其配套糖化血紅蛋白試劑說明書檢測GHb的水平。所有檢測項目均為室內(nèi)質(zhì)控合格。HOMA-IR=空腹血糖(mmol/L)×空腹胰島素(mIU/L)/22.5。采用ELISA法，按照Uranus全自動酶免工作站及其血清TNF-α和MCP-1檢測試劑盒說明書檢測TNF-α及MCP-1水平。Glu參考范圍：4.1～5.9 mmol/L；HbA1c參考范圍：3.6%～6.0%;C肽參考范圍：1.1～4.4 μg/L；HOMA-IR參考范圍：<2.65。

1.5RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 按照TaqMan miRNA提取試劑盒說明書提取上述靜脈血標(biāo)本總RNA，使用640型紫外分光光度計檢測RNA的濃度和純度，取吸光度(A260/280 nm)為1.8～2.0的樣本。按miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，樣本置-20 ℃保存。

1.6實時熒光定量PCR miR-221和內(nèi)參U6的引物參照文獻[6]，由上海生工公司設(shè)計并合成。miR-221上游引物序列：5′-ATCCAGTGCGTGTCGT-3′，下游引物序列：5′-TGCTAGCTACATTGTCTGCT-3′，退火溫度60 ℃。U6上游引物序列：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′，退火溫度60 ℃。熒光定量PCR反應(yīng)體系為20.0 μL，包括: 2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix 4.0 μL、10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL、RNase-free H2O 5.0 μL、cDNA 樣本9.0 μL。采用 7500實時熒光定量PCR儀檢測，循環(huán)參數(shù): 95 ℃預(yù)變性15 min; 95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40個循環(huán)。使用StepOneTM軟件采集熒光信號并進行熔解曲線分析，miR-221的相對表達(dá)水平以2-ΔΔCt法計算，公式: ΔΔCt=[(實驗組Ct目的基因-實驗組Ct內(nèi)參基因)-(對照組Ct目的基因-對照組Ct內(nèi)參基因)]。每組設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1不同治療方案及治療時間對T2DM肥胖患者血清學(xué)指標(biāo)的影響 實驗組和對照組治療前后血清GHb、HOMA-IR、C肽、Glu、miR-221、MCP-1和TNF-α水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，進一步進行兩兩比較，發(fā)現(xiàn)GHb、HOMA-IR、MCP-1和TNF-α水平在相鄰時相點間呈明顯降低趨勢，而C肽和miR-221在相鄰時相點間呈明顯升高趨勢(P<0.05)。與對照組同時相點進行比較，治療3個月后實驗組的HOMA-IR、GHb、FG、MCP-1、TNF-α水平明顯降低，但C肽和miR-221水平明顯升高(P<0.05)。見表2。

表1 不同治療方案與治療時間對T2DM肥胖患者血清學(xué)指標(biāo)的影響(n=43)

2.2T2DM肥胖患者miR-221及HOMA-IR與其他血清學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性 經(jīng)Pearson相關(guān)分析， T2DM肥胖患者血清miR-221水平與MCP-1(r=-0.795,P=0.000)、TNF-α(r=-0.612,P=0.000)、HOMA-IR(r=-0.684,P=0.000)、Glu(r=-0.485,P=0.000)、GHb(r=-0.591,P=0.000)呈負(fù)相關(guān)，與C肽(r=0.653,P=0.000)呈正相關(guān)。T2DM肥胖患者HOMA-IR與MCP-1(r=0.728,P=0.000)、TNF-α(r=0.621,P=0.000)、 Glu(r=0.478,P=0.000)、GHb(r=0.584,P=0.000)呈正相關(guān)，與C肽(r=-0.622,P=0.000)呈負(fù)相關(guān)。

3 討論

二甲雙胍是2型糖尿病腎病防治指南[7]中推薦治療糖尿病的首選藥物。該藥物具有良好的降低血糖、降低血脂、減輕體重、調(diào)節(jié)腸道菌群、降低MCP-1及TNF-α表達(dá)、減少炎癥反應(yīng)等作用[8-9]。本研究結(jié)果表明，對照組T2DM肥胖患者治療后的MCP-1、TNF-α、HOMA-IR、GHb、Glu水平明顯降低，并呈現(xiàn)時間效應(yīng)，證實二甲雙胍能抑制炎癥因子MCP-1、TNF-α的表達(dá)水平、降低Glu和GHb水平，緩解T2DM患者發(fā)生IR[9-10]。

中醫(yī)認(rèn)為脾虛濕困、代謝紊亂是糖尿病發(fā)生的主要原因，通過健脾、益氣和提高機體免疫功能可治療疾病。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，實驗組于治療3個月后患者血清HOMA-IR、GHb、Glu、MCP-1、TNF-α水平明顯降低，進一步的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)T2DM肥胖患者的HOMA-IR與血清MCP-1、TNF-α、GHb、Glu水平間呈正相關(guān)，以上結(jié)果表明，實驗組(聯(lián)合用藥組)在降低Glu、IR及炎癥因子水平方面較對照組(單純二甲雙胍組)的效果更佳，考慮參苓白術(shù)散通過降低炎癥水平、減輕炎癥反應(yīng)，可以緩解IR和高血糖，證實參苓白術(shù)散具有降低炎癥因子(如IL-6、TNF-α、MCP-1等)水平和治療脾虛濕困癥的作用[5]。以上研究表明，參苓白術(shù)散通過降低炎癥因子的表達(dá)，降低Glu和GHb，緩解IR，可以用于治療糖尿病。

微小RNA(miRNA)是一類具有廣泛生物活性的非編碼小分子RNA，在細(xì)胞內(nèi)外進行物質(zhì)傳遞和信號通路分子的調(diào)節(jié)[11-12]。研究表明，miR-221參與機體的炎癥反應(yīng)、IR及胰島素IKK/PKC信號途徑，且肥胖患者血清中miR-221的表達(dá)與TNF-α水平呈負(fù)相關(guān)[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組同時相點比較，實驗組治療3個月后miR-221水平明顯升高，且T2DM肥胖患者miR-221與HOMA-IR、MCP-1、TNF-α、GHb和Glu水平呈負(fù)相關(guān)。以上結(jié)果表明，提高miR-221水平可緩解T2DM患者的IR，降低Glu和GHb，分析原因，可能實驗組miR-221表達(dá)水平升高，降低炎癥因子水平，從而緩解T2DM患者發(fā)生IR，并且降低血糖。但是，miR-221與炎癥因子、HOMA-IR之間的相關(guān)性仍需要進一步研究證實。中藥治療糖尿病機理的一個新關(guān)注點是“菌群-黏膜免疫-炎癥-糖尿病”軸[13]，中藥在體內(nèi)是通過多靶點、多作用機理治療疾病，本研究從“miR-221-炎癥因子-胰島素耐受”方面闡述苓白術(shù)散聯(lián)合二甲雙胍治療糖尿病的機理，為中西藥聯(lián)合治療T2DM提供依據(jù)，為中藥多靶點治療疾病機理研究提供參考。

本研究基于醫(yī)院患者進行研究，尚存在一些不足之處，如患者選擇的偏倚、實驗條件管控的不一致、研究的病例數(shù)不夠多、觀察時間是否足夠長等。此外，對照組設(shè)置不完善，尚缺乏單一中藥組。未來，我們將進一步通過選用動物模型、嚴(yán)控實驗條件等，提高實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，必要時采用體外細(xì)胞實驗驗證各指標(biāo)間的相關(guān)性。

綜上所述，參苓白術(shù)散聯(lián)合二甲雙胍治療T2DM肥胖患者，治療效果優(yōu)于單用二甲雙胍，表現(xiàn)為治療后HOMA-IR和GHb降低，分析原因可能與增加miR-221表達(dá)、降低炎癥因子(MCP-1和TNF-α)水平有關(guān)，但還需要大樣本病例以及動物實驗進一步驗證。