趙欣媛，郭婷，丁鵬

(西安醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院a.婦產(chǎn)科,b.心內(nèi)科，西安 710038)

妊娠合并心臟病孕婦發(fā)生不良事件的風險較高，在產(chǎn)科非直接致孕婦死亡原因中排首位，嚴重威脅孕婦生命健康[1-2]。微小RNA(microRNA，miRNA)與心血管系統(tǒng)疾病關(guān)系密切。miR-27a屬于miR-27家族，在心、肺組織中含量豐富，主要通過調(diào)節(jié)機體代謝、血管生成、炎癥反應(yīng)、脂肪生成、氧化應(yīng)激等過程，參與動脈粥樣硬化、心肌梗死等心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展[3-4]。GATA結(jié)合蛋白6 (GATA binding protein 6，GATA6)是一種重要的心血管內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控心肌細胞轉(zhuǎn)錄、心臟循環(huán)、房室分隔形成等，對心臟發(fā)育過程具有潛在方向性調(diào)控作用，其異常表達與先天性心臟病密切相關(guān)[5]。目前關(guān)于miR-27a、GATA6與妊娠合并心臟病中的研究國內(nèi)尚未見報道。因此，本研究擬通過檢測血清miR-27a、GATA6水平，以期探討其與妊娠合并心臟病孕婦妊娠結(jié)局的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2017年5月至2019年7月西安醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的妊娠合并心臟病孕婦81例作為病例組，年齡(33.24±3.15)歲，孕周(36.57±2.98)周，身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)為(24.15±2.21)kg/m2；納入標準：(1)符合妊娠合并心臟病的診治專家共識(2016)的診斷標準[6]；(2)均經(jīng)24 h動態(tài)心電圖、心臟彩色多普勒超聲等檢查確診；(3)均為初產(chǎn)單胎孕婦；(4)不良妊娠結(jié)局包括早產(chǎn)、胎兒畸形、羊水異?；蛩捞サ?；(5)心功能分級Ⅰ～Ⅳ級；(6)臨床資料完整。排除標準：(1)依從性差，不自愿配合調(diào)查研究者；(2)并發(fā)心律失?；蚱渌麗盒阅[瘤者；(3)患有精神性疾病、認知功能障礙者。參照心功能分級標準[7]進行分級，其中，先天性心臟病38例(左向右分流型包括房間隔缺損12例，室間隔缺損6例；右向左分流型包括法絡(luò)四聯(lián)癥8例；無分流型包括主動脈狹窄7例，肺動脈狹窄5例，心功能Ⅰ級9例，Ⅱ級12例，Ⅲ級10例，Ⅳ級7例)，圍產(chǎn)期心肌病(擴張型)13例(心功能分級Ⅰ級2例，Ⅱ級4例，Ⅲ級5例，Ⅳ級2例)，妊娠高血壓心臟病(患者出現(xiàn)心率加快及心律失常，超聲檢查出現(xiàn)心臟擴大、射血分數(shù)下降，生化檢測心肌酶學、B型利鈉肽異常升高)30例(心功能分級Ⅰ級5例，Ⅱ級7例，Ⅲ級10例，Ⅳ級8例)。另取同期就診的妊娠合并心臟病妊娠結(jié)局良好者81例為對照組，年齡(32.76±3.29)歲，孕周(36.26±3.29)周， BMI為(24.39±2.16)kg/m2。其中，先天性心臟病46例(左向右分流型包括房間隔缺損16例，室間隔缺損7例；右向左分流型包括法絡(luò)四聯(lián)癥8例；無分流型包括主動脈狹窄9例，肺動脈狹窄6例。心功能分級Ⅰ級23例，Ⅱ級14例，Ⅲ級7例，Ⅳ級2例)，圍產(chǎn)期心肌病(擴張型)35例(心功能分級Ⅰ級17例，Ⅱ級13例，Ⅲ級4例，Ⅳ級1例)。兩組妊娠合并心臟病孕婦年齡、孕周、BMI、心臟病類型比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)過西安醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(No.2017041-YY)，患者均知情同意。

1.2主要試劑及儀器 miRNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)， microRNA定量(qRT-PCR)試劑盒、Perfect Real Time逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連TaKaRa公司)，pro-BNP化學發(fā)光檢測試劑盒、cTnI化學發(fā)光免疫分析法檢測試劑盒(南京賽泓瑞生物科技公司)。GENESYS40/50紫外分光光度計(美國Thermo公司)，MODEL550型酶聯(lián)儀、7500型RT-qPCR儀(美國Bio-Rad公司)，ACCES 型電化學發(fā)光儀(美國貝克曼公司)。

1.3方法

1.3.1標本采集 所有孕婦在治療前于孕周29周時采集空腹外周靜脈血3 mL， 1 000×g離心8 min，取上層血清置于EDTA-Na2抗凝的無菌試管中，密封后將試管置于-20 ℃保存。

1.3.2RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 采用miRNA提取試劑盒提取血清總miRNA，用紫外分光光度計檢測總RNA濃度及純度，取吸光度(A280/260 nm)值為1.8～2.0的樣本用于后續(xù)試驗。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，置于-20 ℃保存。

1.3.3實時熒光定量PCR檢測 引物設(shè)計與合成參考文獻[8-9]，根據(jù)NCBI參考序列中miR-27a與GATA6基因的序列號(NC_000019.10和NM_005257)，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，并送上海吉瑪公司合成。miR-27a上游引物序列：5′-GAACTTAGCCACTGTGAACACCACTTGG-3′，下游引物序列：5′-TTGCTTCCTGTCACAAATCACATTG-3′，產(chǎn)物片段大小182 bp,退火溫度60 ℃。GATA6上游引物序列：5′-AGTGCAGACCTGCTGGAGGA-3′，下游引物序列：5′-ACTTGAGCTCGCAGTTCTCG-3′，產(chǎn)物片段大小592 bp，退火溫度64 ℃。RT-qPCR總反應(yīng)體系為20 μL，包括SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL，cDNA(50 ng/μL)2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，ddH2O 6.0 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，72 ℃ 5 s，共40個循環(huán)；于65 ℃時采用Bio-Rad CFX manager 軟件收集熒光信號。以U6為miR-27a的內(nèi)參，GADPH為GATA6的內(nèi)參，采用2-△△Ct法對血清中miR-27a與GATA6mRNA的表達水平進行定量分析，ΔΔCt=(實驗組Ct目的基因-實驗組Ct內(nèi)參基因)-(對照組Ct目的基因-對照組Ct內(nèi)參基因)。每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.3.4血清相關(guān)生化指標檢測 采用化學發(fā)光法，按照pro-BNP化學發(fā)光檢測試劑盒、cTnI檢測試劑盒及化學發(fā)光儀說明書檢測。血清cTnI參考范圍：0～0.2 g/L，pro-BNP參考范圍：0～100 ng/L。

2 結(jié)果

2.1病例組與對照組妊娠心臟病孕婦基線資料比較 病例組早產(chǎn)7例，胎兒畸形2例，羊水異常5例，死胎2例。與對照組比較，病例組心功能分級為Ⅰ+Ⅱ級比例顯著降低，而Ⅲ+Ⅳ級比例顯著增加(P<0.05)。見表1。

表1 病例組與對照組孕婦一般資料比較

2.2病例組與對照組妊娠心臟病孕婦血清miR-27a、GATA6mRNA水平比較 與對照組血清miR-27a水平(2.17±0.41)、GATA6mRNA水平(0.82±0.16)比較，病例組孕婦血清miR-27a水平(3.35±0.56)升高(t=15.303，P<0.001)，GATA6mRNA水平(0.29±0.04)水平降低(t=28.922，P<0.001)。

2.3病例組與對照組妊娠合并心臟病孕婦血清cTnI、pro-BNP水平比較 與對照組血清cTnI(0.21±0.03)μg/L、pro-BNP(287.15±56.82)ng/L比較，病例組血清cTnI(0.46±0.09)μg/L、pro-BNP的表達水平(946.87±125.41)ng/L均顯著升高(t=23.717、43.125，P均<0.001)。

2.4不相同心功能分級患者血清學指標的比較 與心功能分級Ⅰ+Ⅱ級患者比較，Ⅲ+Ⅳ級患者血清中miR-27a、cTnI、pro-BNP表達水平顯著升高，GATA6mRNA水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.001)。見表2。

表2 不相同心功能分級患者血清各指標水平的比較

2.5妊娠合并心臟病孕婦血清miR-27a、GATA6mRNA水平與血清生化指標的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，妊娠合并心臟病孕婦血清miR-27a的表達水平與GATA6mRNA水平呈負相關(guān)(r=-0.499，P<0.05)，與血清cTnI、pro-BNP水平均呈正相關(guān)(r分別為0.512、0.497，P<0.05)，而GATA6mRNA水平與cTnI、pro-BNP水平均呈負相關(guān)(r分別為-0.531、-0.524，P<0.05)。

2.6Logistic回歸分析影響妊娠合并心臟病孕婦不良妊娠結(jié)局的危險因素 以妊娠合并心臟病患者妊娠結(jié)局為因變量，以孕婦年齡、BMI、心功能分級、血清miR-27a、GATA6mRNA、cTnI、pro-BNP水平為自變量，進行Logistic回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，心功能分級高、血清miR-27a、cTnI、pro-BNP水平升高、GATA6mRNA水平降低是影響妊娠合并心臟病孕婦不良妊娠結(jié)局的危險因素(P<0.05)。見表3。

表3 Logistic回歸分析影響妊娠合并心臟病孕婦不良妊娠結(jié)局的危險因素

3 討論

妊娠合并心臟病是產(chǎn)科嚴重并發(fā)癥之一，若未及時控制可導致孕婦心力衰竭及肺栓塞，甚至死亡，嚴重影響妊娠結(jié)局及胎兒生長發(fā)育[10]。研究報道，產(chǎn)前檢查可有效降低妊娠合并心臟病患者心力衰竭等不良事件發(fā)生情況，改善其妊娠結(jié)局[11]。因此尋找妊娠合并心臟病不良妊娠結(jié)局相關(guān)的敏感生物標志物至關(guān)重要。

miR-27a屬于基因間區(qū)域miRNA，有miR-27a-3p、miR-27a-5p兩種異構(gòu)體，在心、肺組織中表達豐富，在動脈粥樣硬化、腦缺血、血管炎癥等心血管疾病中發(fā)揮重要作用[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，病例組孕婦血清miR-27a水平顯著升高，且與患者血清cTnI、pro-BNP水平呈正相關(guān)。房艷紅等[13]研究報道，miR-27a在心肌梗死患者外周血中呈顯著高表達，其可通過抑制Bcl-2表達促進心肌細胞凋亡，提示妊娠合并心臟病孕婦血清miR-27a升高可能與心肌損傷或心功能障礙有關(guān)，進而影響妊娠不良結(jié)局發(fā)生。

GATA6可增加心臟調(diào)控因子的轉(zhuǎn)錄水平，在人類心臟分化、發(fā)育和功能中發(fā)揮重要作用。GATA6基因突變或異常表達與多種先天性心臟病、心律失常、肥厚型心肌病等密切相關(guān)[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，病例組血清GATA6mRNA水平顯著增加，提示GATA6mRNA可能與心臟病有關(guān)。Yoon等[15]研究報道，GATA6是唯一在多能干細胞分化早期顯著誘導的基因，GATA6水平與心肌細胞分化效率呈正相關(guān)。岳峰等[5]研究報道，先天性心臟病患兒孕期母親外周血GATA6mRNA水平顯著低于對照組，GATA6mRNA水平升高是胎兒發(fā)生先天性心臟病的保護因素。本研究與其他文獻報道的結(jié)果基本一致，推測GATA6低表達可能降低對動脈導管閉合的促進作用，增加肺動脈畸形、心臟流出道部位心肌細胞的異常增生，與心肌損傷及心室結(jié)構(gòu)異常有關(guān)。另外GATA6mRNA水平與miR-27a、cTnI、pro-BNP水平均呈負相關(guān)，提示GATA6可能與miR-27a存在拮抗作用，導致妊娠合并心臟病孕婦心臟結(jié)構(gòu)及功能異常，進而誘發(fā)不良妊娠結(jié)局。本研究進一步分析發(fā)現(xiàn)，心功能分級高、血清miR-27a、cTnI、pro-BNP水平升高、GATA6mRNA水平降低是影響妊娠合并心臟病孕婦不良妊娠結(jié)局的危險因素。有研究報道，心功能等級越高，發(fā)生不良妊娠結(jié)局的概率越高[16]，提示血清miR-27a、cTnI、pro-BNP水平升高、GATA6mRNA水平降低可能與心功能等級高有關(guān)，預(yù)示心臟功能差。血清miR-27a、GATA6mRNA水平有潛力成為妊娠合并心臟病孕婦不良妊娠結(jié)局評估的有效參考指標。

綜上所述，血清miR-27a水平增加，GATA6mRNA水平降低可能與妊娠合并心臟病孕婦心肌損傷有關(guān)，是影響患者不良妊娠結(jié)局的危險因素。但本研究也存在不足之處，如研究樣本量較少，針對miR-27a與GATA6在妊娠合并心臟病中具體作用機制尚不清楚，有待加大樣本量深入探究。