洪永興　彭臘如　黃振文　徐天鵬　濮黎萍　虞霖田　謝龍　廖玉英　陸陽清

摘要：【目的】明確FoxO3轉(zhuǎn)錄因子在不同日齡雞卵巢組織中的表達模式及其具體定位情況，為后續(xù)開展家禽卵泡激活及發(fā)育調(diào)控等相關(guān)機理研究提供科學(xué)依據(jù)。【方法】在GenBank中搜索雞與其他物種（鴨、鵝、老鼠、豬、牛及人類）的FoxO3氨基酸序列，通過LaserGene分析雞FoxO3氨基酸序列與其他物種FoxO3氨基酸序列間的親緣關(guān)系及同源差異情況;利用RT-PCR鑒定FoxO3基因是否在雞卵巢組織中表達，再采用實時熒光定量PCR檢測不同發(fā)育階段雞卵巢組織中FoxO3基因的表達水平，最后以免疫熒光檢測FoxO3蛋白在雞卵巢組織中的定位情況。【結(jié)果】雞與鴨和鵝的FoxO3氨基酸序列相似性分別為92.7%和95.3%，基于FoxO3氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹也顯示雞與鴨和鵝的親緣關(guān)系較近，說明FoxO3基因的進化相對較保守。在不同發(fā)育階段的雞卵巢組織中均能檢測到FoxO3基因表達，且FoxO3基因在0日齡雞卵巢組織中的相對表達量最高，顯著高于在其他發(fā)育階段的相對表達量（P<0.05）。在0日齡雞卵巢組織中未檢測到FoxO3蛋白，但在21日齡和成年雞的卵巢組織中均能檢測到FoxO3蛋白;在21日齡雞卵巢組織中FoxO3蛋白主要定位在原始卵泡細胞周圍，在卵泡內(nèi)部沒有表達;而在成年雞卵巢組織中FoxO3蛋白僅定位于大卵泡細胞邊緣，小卵泡細胞內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)FoxO3蛋白?！窘Y(jié)論】由于雞和哺乳動物的FoxO3氨基酸序列高度同源，且FoxO3蛋白在雞卵巢組織中的定位與在哺乳動物卵巢組織中的定位相似，說明FoxO3在雞卵巢組織中發(fā)揮著與哺乳動物相似的功能，即在卵泡激活與成熟過程中發(fā)揮重要作用，因此通過調(diào)控FoxO3能有效提高雞的繁殖性能。

關(guān)鍵詞： 雞;FoxO3轉(zhuǎn)錄因子;卵巢;卵泡激活;表達定位

中圖分類號： S831.89? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）08-1849-08

Identification of expression of FoxO3 transcription factor in chicken ovaries

HONG Yong-xing1， PENG La-ru1， HUANG Zhen-wen1， XU Tian-peng1， PU Li-ping1，

YU Lin-tian2， XIE Long1， LIAO Yu-ying3，? LU Yang-qing1*

（1College of Animal Science and Technology， Guangxi University/State Key Laboratory of Subtropical Agricultural Biological Resources Conservation and Utilization， Nanning? 530004， China; 2Guangxi Agricultural Vocational and Technical College， Nanning? 530007， China; 3Guangxi Animal Husbandry Research Institute， Nanning? 530021， China）

Abstract：【Objective】The expression pattern and specific localization of FoxO3 transcription factor in ovarian tissue of chickens at different ages were determined， providing a basis for the subsequent studies on related mechanisms such as follicular activation and developmental regulation in poultry. 【Method】FoxO3 amino acid sequences of chicken and other species（duck， goose， mouse， pig， ox and human） were searched in GenBank， and the genetic relationship and homologous difference between FoxO3 amino acid sequence of chicken and FoxO3 amino acid sequence of other species were analyzed by Laser Gene. RT-PCR was used to identify whether FoxO3 gene was expressed in chicken ovarian tissue. Then real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect FoxO3 gene expression level in chicken ovarian tissue at different stages. Finally， immunofluorescence was used to detect FoxO3 protein localization in chicken ovarian tissue. 【Result】The similarity of FoxO3 amino acid sequence between chicken and duck and goose was 92.7% and 95.3%， respectively. The phylogenetic tree based on T-PCR similarity also showed that chicken was closely related to duck and goose， indicating that FoxO3 gene was relatively conservative in evolution.FoxO3 gene expression could be detected in different stages of chicken ovarian tissue， and the relative expression level of FoxO3 gene in 0-day-old chicken ovarian tissue was the highest， significantly higher than the relative expression level in other stages（P<0.05）. FoxO3 protein was not detected in the ovarian tissue of 0-day-old chickens， but FoxO3 protein was detected in the ovarian tissue of 21-day-old and adult chi-ckens. FoxO3 protein was mainly localized around the original follicle cells in the ovarian tissue of chicken at 21 days old， but was not expressed in the follicle. FoxO3 was found only at the edges of large follicular cells in adult chicken ova-rian tissue， but not in small follicular cells. 【Conclusion】Since the chicken and mammals FoxO3 amino acid sequence has high homology， the location in the chicken and FoxO3 protein in ovarian tissue is similar to the location in the ovarian tissue in mammals， which indicates thatFoxO3 in chicken ovary organization plays a similar function as mammals.The follicle plays an important role in the process of activation and mature， so through regulating FoxO3 can effectively increase the reproductive performance of chicken.

Key words： chicken; FoxO3 transcription factor; ovary; follicle activation; localization of gene expression

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31960157）

0 引言

【研究意義】叉頭框（Forkhead box，F(xiàn)ox）轉(zhuǎn)錄因子最早在果蠅上被發(fā)現(xiàn)，其在大腸桿菌及人類細胞中均有表達，可發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)（Jünger et al.，2003）。Fox家族具有許多亞族，其中O亞家族（FoxO）被稱為癌因子或腫瘤抑制因子，在癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用（張楠和王育，2015;黃林艷等，2019;Gurnari et al.，2019）。FoxO通過不同的信號通路調(diào)節(jié)細胞生長發(fā)育，其中FoxO3在動物卵泡激活及其成熟過程中起調(diào)節(jié)作用（Pelosi et al.，2013;陳亞楠等，2016;黃堅毅等，2019）。因此，探究FoxO3在家禽卵泡中的生物學(xué)作用，對揭示家禽產(chǎn)蛋機理及提高其繁殖性能均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，已知的FoxO亞家族由FoxO3a（FKHRL1）、FoxO1（FKHR）和FoxO4（AFX）組成，均為PTEN/PI3K/AKT通路的下游效應(yīng)子（Tran et al.，2003;黃堅毅等，2019），參與細胞增殖、細胞凋亡、抗應(yīng)激、細胞分化及代謝等多種生物學(xué)過程（Accili and Arden，2004;周驊等，2017），但需經(jīng)磷酸化、乙?；蚍核鼗刃揎椇蟛拍馨l(fā)揮作用（周振琪，2007;van der Horst and Burgering，2007）。其中，F(xiàn)oxO3a因與人類壽命存在密切聯(lián)系而引起廣泛關(guān)注，也被稱為長壽基因（Miyamoto et al.，2007;Notas et al.，2012）。FoxO3可通過信號通路調(diào)控細胞凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，進而促進細胞凋亡（Nepal et al.，2015;Hou et al.，2016;黃堅毅等，2019）。已有研究表明，F(xiàn)oxO3是蛋白降解途徑中的激活物，能通過促進肌肉萎縮因子表達而誘導(dǎo)肌肉萎縮（Lee et al.，2004;Sandri et al.，2004）。Castrillon等（2003）研究發(fā)現(xiàn)，敲除雌性小鼠FoxO3a基因后表現(xiàn)出全部卵泡激活的卵巢表型，導(dǎo)致卵母細胞死亡、功能性卵巢卵泡早期耗竭和繼發(fā)性不育，進一步證實FoxO3在卵泡生長最早階段主要發(fā)揮抑制卵泡激活的作用。此外，F(xiàn)oxO3可通過調(diào)控細胞周期相關(guān)基因來延長細胞周期（Du et al.，2016）。在雞的相關(guān)研究領(lǐng)域，Chen等（2019）研究表明，F(xiàn)oxO3不僅能抑制雞肝癌細胞系（LMH）增殖，促進細胞凋亡，還與雞的生長發(fā)育存在密切聯(lián)系;Lee等（2019）通過抑制FoxO3基因在雞成肌細胞中的表達，發(fā)現(xiàn)其成肌細胞增殖率明顯低于正常成肌細胞，說明FoxO3具有促進雞成肌細胞增殖的作用?！颈狙芯壳腥朦c】鑒于FoxO3在動物卵泡激活及卵母細胞發(fā)育過程中發(fā)揮的重要作用，故推測其在雞卵巢內(nèi)也具有抑制卵泡激活的作用，即通過控制蛋雞FoxO3基因表達可增加蛋雞的產(chǎn)蛋量，但至今有關(guān)家禽FoxO3的相關(guān)研究仍處于初級階段，尚未明確其在雞卵巢中的定位及功能作用?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹比對分析家禽（雞、鴨和鵝）與哺乳動物（豬、牛、小鼠及人類）的FoxO3氨基酸序列相似性，并以實時熒光定量PCR和免疫熒光等方法檢測FoxO3基因在不同發(fā)育階段雞卵巢中的表達模式及其具體定位情況，為后續(xù)開展家禽卵泡激活及發(fā)育調(diào)控等相關(guān)機理研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試廣西麻雞（0日齡、21日齡和成年雞各3羽）購自廣西富鳳農(nóng)牧集團有限公司。ProLongTM Gold Antifade Mountant with DAPI（P36931）購自Invitrogen公司，E.Z.N.A Total RNA Kit I（R6834-02）購自O(shè)MEGA Bio-tek Inc.公司，Alexa Fluor 488 GOAT A 0.5 ML（A11034）購自Thermo-life公司，EasyScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（AE311-04）購自TransGen Biotech公司，TB GreenTM Premix Ex Taq II（RR820A）購自TaKaRa公司，Albumin from Bovine Serum（A9418-50G）購自Sigma公司，4%多聚甲醛購自北京博奧拓達科技有限公司，二甲苯和無水乙醇購自天津富宇精細化工有限公司。主要儀器設(shè)備：Milli-Q純水系統(tǒng)（美國Milli-Q公司），2T-12M型組織脫水機（孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司），倒置顯微鏡TH4-200（日本Olympus公司），免疫熒光系統(tǒng)（日本Olympus公司），CFX96TM Real-Time System（Bio-Rad公司）。

1. 2 生物信息學(xué)分析

在GenBank中搜索雞與其他物種（鴨、鵝、小鼠、豬、牛及人類）的FoxO3氨基酸序列，通過LaserGene分析雞FoxO3氨基酸序列與其他物種FoxO3氨基酸序列間的親緣關(guān)系及同源差異情況，以MEGA 10.0中的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1. 3 擴增引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank已公布的雞FoxO3基因序列，利用Primer 5.0設(shè)計特異性引物（表1），并委托深圳華大基因股份有限公司合成。

1. 4 總RNA提取及cDNA第一鏈合成

取雞卵巢組織塊迅速加入液氮研磨至粉末，利用RNA提取試劑盒[E.Z.N.A Total RNA Kit I（R6834-02）]提取總RNA，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒[Easy-Script? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（AE311-04）]說明將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

1. 5 PCR擴增

以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進行PCR擴增，反應(yīng)體系20.0 μL，其中，1.0 μmol/L的上、下游引物各1.0 μL，PrimeSTAR? Max DNA Polymerase 10.0 ?L，cDNA模板10 ng，加Milli-Q水補足至20.0 μL。擴增程序：98 ℃預(yù)變性10 s;98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 5 s，進行40個循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物以2.0%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1. 6 實時熒光定量PCR檢測

以GAPDH基因為內(nèi)參基因進行實時熒光定量PCR擴增，反應(yīng)體系20.0 μL，其中，1.0 μmol/L的上、下游引物各1.0 μL，TB GreenTM Premix Ex Taq II 10.0 ?L，cDNA模板10 ng，加Milli-Q水補足至20.0 μL。擴增程序：95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進行40個循環(huán);熔解程序：95 ℃ 5 s，65 ℃ 5 s，95 ℃ 5 s。

1. 7 免疫熒光定位檢測

分別取0日齡、21日齡及成年雞的卵巢組織，在4 ℃下以4%多聚甲醛固定過夜，經(jīng)組織脫水機自動脫水、透明及浸蠟后，制作3～5 μm的石蠟切片。參考黃斌等（2018）的方法進行免疫熒光染色：切片經(jīng)脫蠟梯度復(fù)水后，在95 ℃下處理20 min進行抗原修復(fù);以5% H2O2處理切片組織15 min，去除內(nèi)源性過氧化氫酶;在室溫下以3%牛血清白蛋白（BSA）封閉1.5 h，滴加一抗（按說明比例稀釋于含5% BSA的PBS中）后置于4 ℃濕盒過夜，滴加堿性磷酸酶標記的二抗（按說明比例稀釋于含5% BSA的PBS中）后在室溫下孵育1.0 h，再滴加DAPI和放淬滅劑，封片，于熒光顯微鏡下進行鏡檢。

2 結(jié)果與分析

2. 1 FoxO3基因生物信息學(xué)分析結(jié)果

為檢測家禽（雞、鴨和鵝）與哺乳動物（小鼠、牛、豬及人類）的FoxO3基因種間差異，采用MegAlign對各物種的FoxO3氨基酸序列進行比對，并基于FoxO3氨基酸序列相似性構(gòu)建雞與其他6個物種的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)果顯示，雞FoxO3氨基酸序列與鴨、鵝、小鼠、牛、豬及人類FoxO3氨基酸序列的相似性分別為92.7%、95.3%、78.5%、79.1%、78.6%和78.9%（圖1），從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹也可知，雞與鴨和鵝的親緣關(guān)系較近，聚類在同一分支上（圖2），說明FoxO3基因的進化相對較保守。

2. 2 FoxO3基因在雞卵巢組織中的表達鑒定結(jié)果

為檢測FoxO3基因在雞卵巢組織中是否表達，以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果（圖3）顯示在180 bp附近獲得1條明亮的目的條帶，經(jīng)測序證實其為雞FoxO3基因編碼區(qū)（CDS）序列片段，說明FoxO3基因在雞卵巢組織中有表達。

2. 3 雞FoxO3基因?qū)崟r熒光定量PCR的熔解曲線

GAPDH基因和FoxO3基因?qū)崟r熒光定量PCR的熔解曲線如圖4所示。GAPDH基因和FoxO3基因的熔點分別為86.0和80.5 ℃，熔解曲線均呈單峰，說明本研究設(shè)計的擴增引物特異性強，無引物二聚體等非特異性擴增，即實時熒光定量PCR檢測數(shù)據(jù)準確可信。

2. 4 雞FoxO3基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測結(jié)果

從圖5可看出，除空白對照未擴增出對應(yīng)的熒光曲線外，從不同日齡雞卵巢組織中均能擴增出GAPDH基因和FoxO3基因的熒光曲線，表明總RNA提取質(zhì)量及cDNA反轉(zhuǎn)錄合成效果良好，且實時熒光定量PCR檢測結(jié)果可信。

2. 5 FoxO3基因在雞卵巢組織中的表達情況

為檢測不同發(fā)育階段雞卵巢組織中FoxO3基因的表達情況，分別收集0日齡、21日齡和成年雞的卵巢組織，提取各發(fā)育階段雞卵巢組織總RNA，采用實時熒光定量PCR測定FoxO3基因的表達量。由于FoxO3基因在原始生殖干細胞（PGCs）中的表達量較低，故將其設(shè)為對照樣本。如圖6所示，在不同發(fā)育階段的雞卵巢組織中均能檢測到FoxO3基因表達，且FoxO3基因在0日齡雞卵巢組織中的相對表達量最高，顯著高于在其他發(fā)育階段的相對表達量（P<0.05）;FoxO3基因在21日齡和成年雞卵巢組織中的相對表達量差異不顯著（P>0.05）。

2. 6 FoxO3蛋白在雞卵巢組織中的定位情況

為檢測FoxO3蛋白在不同發(fā)育階段雞卵巢組織中的定位情況，分別收集0日齡、21日齡和成年雞的卵巢組織，按常規(guī)方法制作石蠟切片后進行免疫熒光染色。免疫熒光染色結(jié)果表明，在0日齡雞卵巢組織中未檢測到FoxO3蛋白（圖7），而在21日齡（圖8）和成年雞（圖9）卵巢組織中均能檢測到FoxO3蛋白。結(jié)合熒光定位來看，在21日齡雞卵巢組織中FoxO3蛋白主要定位在原始卵泡細胞周圍，在卵泡內(nèi)部沒有表達;而在成年雞卵巢組織中FoxO3蛋白僅定位于大卵泡細胞邊緣，小卵泡細胞內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)FoxO3蛋白。

3 討論

哺乳動物的卵母細胞被顆粒細胞緊密包圍形成原始卵泡，且在很長一段時間內(nèi)保持靜止狀態(tài)。FoxO3是維持卵巢儲備功能的重要轉(zhuǎn)錄因子，嚴格管控著卵泡募集和激活等過程，以防止早期卵泡儲集層過早衰竭（卵巢功能早衰）（Schlessinger et al.，2010;Pelosi et al.，2013）。在原始卵泡和初級卵泡階段，F(xiàn)oxO3主要分布在卵核內(nèi)，當卵泡進入次級卵泡階段，其消失在卵核內(nèi)而出現(xiàn)在卵泡邊緣，暗示FoxO3可能與原始卵泡的激活存在密切聯(lián)系。此外，在小鼠上通過基因敲除和轉(zhuǎn)基因等手段進一步證實FoxO3基因在原始卵泡激活過程中起調(diào)控開關(guān)作用（John et al.，2008;Pelosi et al.，2013）。但至今有關(guān)FoxO3在禽類卵泡激活及發(fā)育方面的研究鮮見報道。

本研究結(jié)果表明，在0日齡雞卵巢組織中能檢測到FoxO3基因表達，且其相對表達量顯著高于在21日齡和成年雞卵巢組織中的相對表達量，但免疫熒光檢測未發(fā)現(xiàn)FoxO3蛋白，可能是由于0日齡雞卵巢組織中的原始卵泡尚未激活，原始卵泡的生理活動較弱，其轉(zhuǎn)錄的mRNA并非直接翻譯成蛋白而行使生物學(xué)功能，而是儲存在細胞中為后續(xù)的卵泡激活抑制做準備。在21日齡雞卵巢組織中，F(xiàn)oxO3基因相對表達量雖然顯著低于0日齡雞卵巢組織，但此時雞卵巢組織中已出現(xiàn)FoxO3蛋白，且主要分布在原始卵泡周圍的顆粒細胞中，而不是存在于原始卵泡內(nèi)。因此，推測FoxO3在家禽卵巢組織中具有抑制原始卵泡激活，以維持卵巢庫存量的作用。大量未激活的原始卵泡聚集在一起構(gòu)成原始卵泡池，而原始卵泡池大小是衡量雌性動物生育能力的一個重要指標，是生殖壽命的近似決定因素（McGee and Hsueh，2000）。說明FoxO3可能與家禽的產(chǎn)蛋性能直接相關(guān)，尤其是蛋雞的產(chǎn)蛋周期和終生產(chǎn)蛋量。此外，在成年家禽中FoxO3蛋白存在于卵母細胞的外圍細胞質(zhì)中，說明FoxO3由卵泡核向胞質(zhì)轉(zhuǎn)移，與在哺乳動物上的研究結(jié)果（Pelosi et al.，2013）一致，同時暗示FoxO3在禽類卵母細胞的成熟與發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。FoxO3蛋白在不同發(fā)育階段雞卵巢組織中的定位差異則說明FoxO3在卵泡發(fā)育不同階段發(fā)揮不同功能作用。由于禽類和哺乳動物的FoxO3氨基酸序列高度同源（對應(yīng)相似性均在78.0%以上），且FoxO3蛋白在家禽卵巢組織中的定位與在哺乳動物卵巢組織中的定位相似，因此推測FoxO3在家禽中發(fā)揮著與哺乳動物相似的功能。

本研究對FoxO3基因在雞卵巢組織中的定位及表達模式進行探究，為后續(xù)開展家禽卵泡激活及發(fā)育調(diào)控等相關(guān)機理研究提供了科學(xué)依據(jù)，即有望通過控制FoxO3來提高雞的繁殖性能。至今，關(guān)于FoxO3調(diào)控動物原始卵泡激活的作用機理尚未完全明確。雖然已確定FoxO3是調(diào)控原始卵泡激活的重要開關(guān)，但其開關(guān)作用受何種信號啟動仍未知，且FoxO3是直接主動控制觸發(fā)卵母細胞生長還是通過間接作用方式促進卵泡活化也未明確。現(xiàn)有針對FoxO3功能的研究主要集中在人類（Wang et al.，2010）及小鼠（Castrillon et al.，2003）、豬（Matsuda et al.，2012）和牛（Bromfield and Sheldon，2013）等哺乳動物上，而有關(guān)FoxO3對于鳥類、爬行動物及水生動物等的具體功能仍有待進一步探究。

4 結(jié)論

由于雞和哺乳動物的FoxO3氨基酸序列高度同源，且FoxO3蛋白在雞卵巢組織中的定位與在哺乳動物卵巢組織中的定位相似，說明FoxO3在雞卵巢組織中發(fā)揮著與哺乳動物相似的功能，即在卵泡激活與成熟過程中發(fā)揮重要作用，因此通過調(diào)控FoxO3能有效提高雞的繁殖性能。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）

收稿日期：2019-09-17

基因項目：國家自然科學(xué)基金項目（31960157）

作者簡介：*為通訊作者，陸陽清（1976-），博士，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事干細胞及動物繁殖生物技術(shù)研究工作，E-mail：38360218@qq.com。洪永興（1994-），研究方向為動物遺傳育種與繁殖，E-mail：455842143@qq.com