趙長潤　張文　董志華　陳基明　范文勝　唐寧　韋天超　磨美蘭　韋平

要：【目的】明確產蛋雞源傳染性支氣管炎病毒（IBV）分離株（GX-YL170808）的結構基因及抗原變異情況，為廣西種雞場的傳染性支氣管炎（IB）防控提供科學依據。【方法】通過雞胚尿囊液血凝試驗、雞胚侏儒化試驗及3'端非編碼區(qū)（3'-UTR）測序對分離株進行鑒定;采用RT-PCR擴增S1、E、M和N基因，以MegAlign和MEGA 6.0分別進行核苷酸序列相似性及系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析，運用RDP4和SimPlot對S1、E、M和N基因進行重組分析，利用NetNGlyc 1.0和NetOGlyc 4.0進行糖基化位點預測分析，并通過中和試驗進行血清型鑒定?！窘Y果】分離株的雞胚尿囊液血凝試驗呈陰性，雞胚盲傳5代后出現侏儒胚典型病變，其3'-UTR序列與IBV的3'-UTR序列相似性為99.13%;綜合病雞臨床癥狀及其病理變化可確定該病毒為IBV，命名為GX-YL170808。GX-YL170808分離株S1、E、M和N基因的開放閱讀框（ORF）長度分別為1620、327、675和1230 bp，對應編碼540、109、225和410個氨基酸殘基，與參考株的核苷酸序列相似性分別為60.4%～96.5%、81.8%～97.2%、85.6%～93.5%和85.7%～92.0%;GX-YL170808分離株的S1、M和N基因屬于LX4型，而E基因屬于LDT3型;4個結構基因內部均無重組區(qū)域;除S1基因同時具有N-糖基化和O-糖基化位點外，E、M和N基因均只有N-糖基化位點;S1蛋白裂解位點為HRRRR，與參考株LX4的裂解位點相同。GX-YL170808分離株屬于血清4型，不同于常用的疫苗株H120（血清3型）和4/91（血清5型），也不同于廣西主要侵害雛雞的IBV優(yōu)勢血清型。【結論】產蛋雞源IBV分離株并非疫苗株，其基因型和血清型均已發(fā)生變異，且該毒株的血清型不同于廣西地區(qū)侵害雛雞的優(yōu)勢血清型，提示了廣西地區(qū)IB防控的嚴峻性及新型多價疫苗研發(fā)的緊迫性。

關鍵詞： 產蛋雞;傳染性支氣管炎病毒（IBV）;分離鑒定;結構基因;基因型;血清型

中圖分類號： S858.31? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）08-1816-07

Isolation and identification of an infectious bronchitis virus from laying hens and analysis of its genetic variability and serotype

ZHAO Chang-run， ZHANG Wen， DONG Zhi-hua， CHEN Ji-ming， FAN Wen-sheng，TANG Ning， WEI Tian-chao， MO Mei-lan*， WEI Ping*

（College of Animal Science and Technology， Guangxi University， Nanning? 530004， China）

Abstract：【Objective】The objective was to identify the structural genes and antigenic variation of infectious bronchitis virus （IBV） isolate GX-YL170808 from laying hens， and to provide scientific basis for the prevention and control of infectious bronchitis （IB） in breeder? farms in Guangxi. 【Method】The virus was identified by hemagglutinin test， chicken embryo dwarf test and gene sequence analysis of the 3' untranslated region（3'-UTR）. The S1， E， M and N genes were amplified by RT-PCR， and the nucleotide sequence similarity and phylogenetic tree analysis were carried out by MegAlign and MEGA 6.0; the recombined analysis of S1， E， M and N genes were conducted by RDP4 and SimPlot; the glycosyla-tion sites prediction analysis were carried out with NetNGlyc 1.0 and NetOGlyc 4.0， and serotype identification was carried out by neutralization test. 【Result】The results showed that the hemagglutination test was negative and dwarf embryo appeared typical lesions after five generations; the similarity between isolate GX-YL170808 and reference IBV strains in 3'-UTR was 99.13%. According to the clinical symptoms and pathological changes of the chickens， the virus was determined as IBV， named GX-YL170808. The open reading frame（ORF） length of S1， E， M and N genes of GX-YL170808 isolate were 1620， 327， 675 and 1230 bp， corresponding to 540， 109， 225 and 410 amino acid residues. The nucleotide sequence similarity between S1， E， M and N genes of GX-YL170808 isolate and reference strain were 60.4%-96.5%， 81.8%-97.2%， 85.6%-93.5% and 85.7%-92.0%. The S1， M and N genes belonged to LX4 type， while E gene belonged to LDT3 type. There was no recombination region in the S1， E， M and N structural genes. The E， M and N genes had only N-glycosylation sites except S1 gene had both N and O-glycosylation sites， and the S1 protein cleavage site of the isolate was HRRRR， which was the same as the reference strain LX4. The GX-YL170808 isolate belonged to serotype 4， which was different from those of vaccine strains H120（serotype 3） and 4/91（serotype 5）， and also different from the dominant serotype of IBV which mainly affected the chicks in Guangxi. 【Conclusion】The IBV isolate GX-YL170808 from laying hens is not vaccine strain， and its genotype and serotype have mutated， and the serotype of this strain is different from the dominant serotype which affects the chicks in Guangxi， suggesting that the severity of IBV prevention and control in Guangxi and the urgency of new multivalent vaccine development.

Key words： laying hens; infectious bronchitis virus（IBV）; isolation and identification; structural gene; genotype; serotype

Foundation item： Guangxi Science and Technology Key Project（Guike AA17204057）; Guangxi Natural Science Foundation（2018GXNSFAA281009）; Guangxi Broiler Industry Innovation Team Construction Special Project of National Modern Agricultural Industrial Technology System（nycytxgxcxtd-19-03）

0 引言

【研究意義】雞傳染性支氣管炎（Infectious bronchitis，IB）是由冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒屬（Coronavirus）雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）引起的一種急性、高度接觸性傳染病，主要侵害呼吸道、生殖器官和泌尿系統(tǒng)（Cook et al.，2012;Chen et al.，2017;李智超等，2018），其臨床癥狀表現為打噴嚏、氣管啰音、咳嗽及產蛋量和雞蛋品質下降等（Cavanagh，2007;何怡寧等，2016）。IBV基因組極易發(fā)生變異，導致新基因型甚至新血清型毒株的出現（周海生等，2017;吳倩倩等，2019），給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經濟損失。因此，及時準確掌握IBV地方流行株的基因變異和抗原變化，對有效防控IBV感染蔓延及促進養(yǎng)雞產業(yè)持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】IBV為線性單股正鏈RNA病毒，其基因組全長約27.6 kb（Mo et al.，2013b），具有5'端帽子結構和3'端poly（A）結構，包含5'-cap-Replicase-S-3a-3b-E-M-5a-5b-N-poly（A）-3'至少10個以上開放閱讀框（ORF）（Lisowska et al.，2017）。IBV包含4種結構蛋白（Gao et al.，2016），分別為纖突（S）蛋白、小膜（E）蛋白、膜（M）蛋白和核衣殼（N）蛋白。其中，S蛋白在轉錄后被切割成S1和S2 2個亞蛋白（Jiang et al.，2017），S1蛋白包含3個高度可變區(qū)（HVRI、HVRII和HVRIII）。S1蛋白與病毒的免疫原性、組織嗜性、致病性及遺傳變異和血清型等密切相關（Belouzard et al.，2012），且S1基因常用于IBV基因分型（Li et al.，2010）。N蛋白在病毒復制、組裝及細胞免疫過程中發(fā)揮重要作用（Cook et al.，2012）;E蛋白協助病毒完成出芽和病毒樣顆粒產生（Li et al.，2010）;M蛋白與N蛋白相互作用而將病毒粒子結合到囊膜上，完成病毒的出芽和裝配過程（Feng et al.，2017）。近年來的相關研究表明，除了S1基因極易變異外，M基因、N基因和E基因也出現不同程度的變異（Mo et al.，2013a），且因S1基因重組產生的IBV變異株日趨增多。在英國（Gough et al.，2008）、澳大利亞（Mardani et al.，2010）、韓國（Lim et al.，2015）和美國（Marandino et al.，2016）等國家均新發(fā)現有IBV變異株是通過S1基因不同亞群間重組而產生。周海生（2017）研究表明，近年國內分離獲得的IBV流行株S1基因組中存在不同程度的點突變和重組現象，疫苗株也頻繁參與IBV地方分離株的基因重組。本課題組前期研究發(fā)現，廣西存在多個流行的IBV基因型和血清型，其中大部分流行株的基因型和血清型均不同于常用疫苗株，且在不同時期存在不同的優(yōu)勢基因型和血清型;雖然大部分廣西IBV分離株的結構基因發(fā)生不同程度變異，但基因的進化并不完全平行（張麗華等，2016）。近年來，本課題組已從廣西各地分離鑒定獲得100多株IBV分離株，但主要來源于雛雞群體（Mo et al.，2013a，2013b）。【本研究切入點】從廣西某種雞場發(fā)生產蛋率下降、產軟殼蛋等現象的140日齡種雞群分離獲得1株IBV分離株（GX-YL170808），但該分離株與廣西目前主要侵害雛雞的流行株是否相關尚未明確?！緮M解決的關鍵問題】在雞胚接種試驗、RT-PCR和3'端非編碼區(qū)（3'-UTR）序列分析的基礎上，進一步對GX-YL170808分離株的結構基因及血清型進行分析，旨在了解該分離株的結構基因及抗原變異情況，為廣西種雞場的IB防控提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

廣西某種雞場140日齡種雞群出現產蛋率下降和產軟殼蛋，同時伴有氣管啰音，解剖可見氣管黏膜出血、輸卵管炎癥及花斑腎等病變，無菌采取發(fā)生病變的氣管、輸卵管和腎臟等樣品。發(fā)病雞群免疫程序為：1、7、9、23和60日齡免疫新支二聯苗（IBV H120株），75日齡免疫新支流三聯苗（IBV H120株），120日齡免疫新支流法四聯苗（IBV H120株）。SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司;普通雞胚購自廣西富鳳農牧有限公司。TRIzol試劑、HiFi-Script cDNA第一鏈合成試劑盒及2×Taq Master Mix購自北京康維世紀生物科技有限公司;pMD18-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司;大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞由本課題組制備保存;DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。7種不同的IBV單因子血清（血清型1～血清型7）參照Li等（2012）的方法制備;3'-UTR、S1、E、M和N基因的特異性引物參照Mo等（2013b）的方法進行設計，委托北京華大基因研究中心合成。

1. 2 病毒分離與鑒定

氣管、輸卵管和腎臟等病料樣品與滅菌PBS按1∶3比例充分研磨，反復凍融3次后，12000 r/min離心5 min，取上清液，無菌檢測后加入青鏈霉素（雙抗）至終濃度100 U/mL，取0.3 mL上清液接種于9日齡SPF雞胚尿囊腔，37 ℃培養(yǎng)72 h后無菌收集雞胚尿囊液，以未接種病毒的SPF雞胚尿囊液為陰性對照，進行血凝試驗和3'-UTR序列擴增及測序鑒定;將尿囊液繼續(xù)盲傳5代后觀察雞胚病變。

1. 3 S1、E、M和N基因PCR擴增及測序分析

參照總RNA抽提試劑盒說明抽提雞胚尿囊液RNA，并采用HiFi-Script cDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉錄，然后進行PCR擴增，將PCR擴增產物回收純化、克隆、轉化后提取重組質粒進行PCR鑒定，陽性重組質粒送至北京華大基因研究中心測序。

1. 4 生物信息學分析

測序獲得的S1、E、M和N基因序列用MegAlign和MEGA 6.0分別進行核苷酸序列相似性及系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析，參考毒株包括常用疫苗株、國內分離株和國際參考株（Mo et al.，2013a，2013b）。采用RDP4和SimPlot對S1、E、M和N基因進行重組分析;應用NetNGlyc 1.0和NetOGlyc 4.0對S1、E、M和N蛋白進行N-糖基化位點和O-糖基化位點預測分析。

1. 5 血清型鑒定

參照唐寧（2018）的方法制備和培養(yǎng)雞胚氣管環(huán)，采用Reed-Muench計算分離株的雞胚氣管環(huán)半數感染量（TOC-ID50）。IBV血清分型根據廣西大學養(yǎng)禽與禽病學研究所已建立的標準進行鑒定;固定病毒稀釋度為200 TOC-ID50稀釋各單因子血清，病毒與血清混合作用后，雞胚氣管環(huán)組織物出現纖毛且停止運動的最高稀釋倍數即為該血清的中和滴度。

2 結果與分析

2. 1 病毒分離及鑒定結果

雞胚尿囊液血凝試驗結果與陰性對照組的結果一致，均未出現血凝現象;但經雞胚盲傳5代后其胚體出現侏儒胚典型病變（圖1）。提取雞胚尿囊液RNA后，采用3'-UTR擴增引物進行RT-PCR鑒定，結果擴增得到約330 bp的目的條帶（圖2）。測序結果通過NCBI進行BLAST比對分析，發(fā)現與IBV的3'-UTR序列相似性為99.13%;綜合病雞臨床癥狀及其病理變化，確定該分離株為IBV，命名為GX-YL170808。

2. 2 分離株S1、E、M和N基因擴增及測序結果

采用特異性引物對GX-YL170808分離株的S1、E、M和N基因進行擴增，結果顯示擴增獲得的各目的基因片段均與預期結果相符（圖3）。測序結果表明，GX-YL170808分離株S1、E、M和N基因的ORF分別為1620、327、675和1230 bp，對應編碼540、109、225和410個氨基酸殘基。

2. 3 分離株S1、E、M和N基因核苷酸序列相似性分析結果

MegAlign分析結果顯示，GX-YL170808分離株與參考株的S1、E、M、N基因核苷酸序列相似性分別為60.4%～96.5%、81.8%～97.2%、85.6%～93.5%和85.7%～92.0%。與疫苗株H120、LDT3和4/91相比，除N基因僅存在點突變外，GX-YL170808分離株的S1、M和E基因均存在氨基酸插入或缺失現象（表1）。

2. 4 分離株S1、E、M和N基因遺傳進化分析結果

由圖4可知，在基于S1、M和N基因核苷酸序列相似性構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹上，GX-YL170808分離株均與參考株LX4處于同一分支，即屬于LX4型;而在基于E基因核苷酸序列相似性構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹上，GX-YL170808分離株與參考株LDT3處于同一分支，屬于LDT3型。

2. 5 分離株S1、E、M和N基因重組及其編碼蛋白糖基化位點預測分析結果

采用RDP4分析GX-YL170808分離株S1、E、M和N基因是否發(fā)生重組，并應用SimPlot進行重組結果驗證，結果顯示4個基因內部均無重組區(qū)域。編碼蛋白糖基化位點預測分析結果顯示，GX-YL170808分離株除S1基因有28個O-糖基化位點外，E、M和N基因均無O-糖基化位點;而S1、E、M和N基因分別有16、3、2和1個N-糖基化位點（圖5）。此外，S1蛋白裂解位點為HRRRR，與參考株LX4的裂解位點相同。

2. 6 血清型鑒定結果

Reed-Muench計算結果顯示，GX-YL170808分離株的TOC-ID50/mL為10-4.57。在此基礎上進行中和試驗，并依據中和試驗計算相關系數（R<0.25），其判斷標準為中和滴度相同或相差1個滴度即屬于同一血清型。結果（表2）顯示，GX-YL170808分離株與GX-YL1的中和滴度最高，為同一血清型（血清4型），與常用疫苗株H120（血清3型）和4/91（血清5型）的血清型均不同。

3 討論

近年來，由于IBV基因組頻繁的點突變、缺失、插入和重組，導致新的變異株不斷產生（Li et al.，2013）。在進化過程中，IBV極易發(fā)生點突變，尤其是頻繁使用弱毒疫苗進行免疫后，極有可能促使野毒株與疫苗株間發(fā)生基因重組而形成新的變異株，導致免疫耐受及免疫逃避等現象發(fā)生，給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大經濟損失。近年來，廣西地區(qū)的IBV基因型和血清型均發(fā)生明顯變異（董志華等，2019），可能是頻繁使用疫苗免疫后，IBV受免疫及環(huán)境壓力雙重作用所致（Jackwood and Lee，2017）。本研究從140日齡且出現產蛋率下降和產軟殼蛋的種雞群分離獲得1株IBV分離株（GX-YL170808），經病毒增殖、血凝試驗、雞胚侏儒化試驗、結構基因序列分析、重組和糖基化位點分析，證實該分離株為IBV變異株，中和試驗結果也表明GX-YL170808分離株血清型不同于廣西目前主要侵害雛雞的優(yōu)勢血清型（唐寧，2018）。說明頻繁的結構基因變異及血清型改變可能是種雞群免疫失敗的主要原因之一。

為進一步了解GX-YL170808分離株的流行病學特征，本研究對其4個結構基因（S1、E、M和N）進行擴增及重組分析。由于正股RNA病毒依賴的RNA聚合酶缺乏校正功能，導致IBV極易發(fā)生重組（周海生等，2017）。雖然本研究的基因重組分析結果表明4個結構基因內部均無重組區(qū)域，但系統(tǒng)發(fā)育進化樹顯示其S1、M和N基因屬LX4型，而E基因屬LDT3型。已有研究表明，基因重組可廣泛發(fā)生在IBV基因組的非結構基因等位置（Thor et al.，2011），故不排除GX-YL170808分離株為重組株，且其重組斷點在S1、E、M和N基因之外的可能性。因此，下一步需對該分離株進行全基因組測序分析。

本研究還對GX-YL170808分離株進行血清型鑒定，旨在揭示產蛋雞源IBV分離株的抗原變異特點，結果表明，分離株屬于血清4型，不同于常用的疫苗株H120（血清3型）和4/91（血清5型）。血清型是衡量毒株保護性抗原及免疫保護最常用的指標，也是選擇疫苗及新型疫苗開發(fā)的根據（Li et al.，2012）。GX-YL170808分離株分離自經多次免疫IBV疫苗的產蛋雞，且該分離株與常用疫苗株的基因型及血清型均不相同，既提示了廣西地區(qū)IB防控的嚴峻性，也表明了新型多價疫苗研發(fā)的緊迫性。本課題組曾在2004年的廣西IBV流行株中鑒定出血清4型毒株（張麗華等，2016），但此后很長一段時間內均未發(fā)現血清4型毒株，本研究從140日齡且出現產蛋率下降和產軟殼蛋的種雞群中再次分離獲得血清4型IBV流行株（GX-YL170808）。近年來，廣西IBV流行株的優(yōu)勢血清型為血清2型，而血清4型是否會成為今后廣西IBV流行株的優(yōu)勢血清型，尚需進一步持續(xù)跟蹤調查。

4 結論

產蛋雞源IBV分離株并非疫苗株，其基因型和血清型均已發(fā)生變異，且該毒株的血清型不同于廣西地區(qū)侵害雛雞的優(yōu)勢血清型，提示了廣西地區(qū)IB防控的嚴峻性及新型多價疫苗研發(fā)的緊迫性。

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（責任編輯 蘭宗寶）

收稿日期：2019-08-16

基金項目：廣西科技重大專項（桂科AA17204057）;廣西自然科學基金項目（2018GXNSFAA281009）;國家現代農業(yè)產業(yè)技術體系廣西肉雞產業(yè)創(chuàng)新團隊建設專項（nycytxgxcxtd-19-03）

作者簡介：*為通訊作者：磨美蘭（1973-），博士，教授，主要從事禽病防治與病原分子生物學研究工作，E-mail：momeilan@163.com;韋平（1962-），博士，教授，主要從事禽病防治與病原分子生物學研究工作，E-mail：pingwei8@126.com。趙長潤（1995-），研究方向為預防獸醫(yī)學，E-mail：zcrun628@163.com