殷欣，孟藝偉，趙麗婭，齊君，夏雪奎，高翠玲

(1. 齊魯工業(yè)大學(山東省科學院)山東省科學院生物研究所，山東 濟南 250103; 2. 山東省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院，山東 濟南 250102)

室內(nèi)空氣環(huán)境質(zhì)量與城市人群健康密切相關(guān)。成年人約80%～90%的時間是在室內(nèi)度過的，而在城市中一些行動不便的老人、嬰兒等在室內(nèi)的時間可能高達95%[1]。室內(nèi)空氣若發(fā)生微生物污染，易引起人們(特別是免疫力低下的老人和嬰幼兒)出現(xiàn)頭疼、呼吸道感染[2]、惡心、過敏、皮炎等癥狀。形成室內(nèi)空氣細菌污染的原因一般是通風不好，并且室內(nèi)人員較多，更容易滋生致病微生物。此外，室內(nèi)通風系統(tǒng)的微生物污染也是導致室內(nèi)微生物超標的重要原因[3]。因此，研究室內(nèi)空氣的微生物群落結(jié)構(gòu)變化將對人們的身體健康起到警示和保障作用。

傳統(tǒng)的微生物鑒定方法，主要通過將微生物培養(yǎng)后依據(jù)形態(tài)學、生理生化反應、生態(tài)學特征等進行鑒別。Orji等[4]指出這種方法只能檢測出約1%的重要病原菌，而利用宏基因組學、高通量測序、系統(tǒng)發(fā)育樹分析等技術(shù)，自然界中100%的致病菌都能得到研究。隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展，16S rDNA擴增子測序技術(shù)的應用越來越廣泛，已成為研究大氣、水、油井等環(huán)境樣品中細菌群落結(jié)構(gòu)的重要手段[5-7]。

隨著人們對空氣質(zhì)量與健康關(guān)系認識地不斷加深，如何將室內(nèi)空氣中的雜質(zhì)去除以提高空氣質(zhì)量也受到研究者的關(guān)注。Zhao等[8]通過多級過濾去除了室內(nèi)空氣中大量的灰塵、微生物等雜質(zhì)，從而提高了空氣質(zhì)量。近年來，國內(nèi)越來越多的新風空氣凈化系統(tǒng)進入到各種場所，如商場、醫(yī)院、幼兒園、家庭等。然而新風系統(tǒng)的興起時間較短，人們對于該系統(tǒng)的認識還不夠全面，例如是否能夠高效凈化空氣，保障室內(nèi)空氣的持續(xù)高質(zhì)量而不引發(fā)空氣的二次污染等。目前針對室內(nèi)新風空氣凈化系統(tǒng)，利用測序技術(shù)對其微生物群落結(jié)構(gòu)進行研究，從而探討室內(nèi)空氣的微生物群落結(jié)構(gòu)變化的相關(guān)文獻還未見報道。本文收集了在濟南歷城地區(qū)使用的新風系統(tǒng)空氣濾膜所積累的微生物為樣本，利用16S rDNA擴增子測序技術(shù)進行細菌豐度檢測，以期掌握該地區(qū)室內(nèi)細菌的主要組成成分，并分析潛在的細菌污染風險。

1 材料與方法

1.1 材料

濟南市歷城區(qū)某全國連鎖幼兒園，截至2018年11月31日使用了不同時間的新風系統(tǒng)中的超細玻璃纖維空氣濾膜，分為3個樣本組，每個樣本組含有3個重復樣本(表1)。所有樣本裝入無菌采樣袋中，在4 ℃條件下運輸至實驗室，4 h內(nèi)處理。

表1 不同使用時間的空氣濾膜樣本編號Table 1 Numbers of air-filtration membrane samples used in different time

1.2 樣本處理

(1)每個樣本取15～20片空氣濾膜剪碎，分裝入含有0.9%生理鹽水的50 mL無菌離心管中，4 ℃，200 g離心2 h；(2)輕輕渦旋，用0.22 μm MCE微孔濾膜(貨號：F513134-0001-生工)過濾；(3)收集微孔濾膜，剪碎后用于提取樣本的宏基因組DNA。DNA提取采用DNeasy Power Soil Kit(貨號：12888-50-QIAGEN)。

1.3 16S rDNA擴增子測序

各樣本的宏基因組DNA用無菌水稀釋至終濃度1 ng/μL，并以此為模板，利用16S V3-V4區(qū)通用引物(F：5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′和R：5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)進行PCR擴增[9]。PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收后，使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒(Thermofisher公司)構(gòu)建宏基因組文庫，經(jīng)過定量和檢測后進行高通量測序，測序方法為單端測序(single-end)法。

1.4 測序數(shù)據(jù)處理

使用Cutadapt v1.9.1先對reads進行初步處理得到原始數(shù)據(jù)(raw reads)，然后進行去除嵌合體序列的處理，得到有效數(shù)據(jù)(clean reads)。利用Uparse v7.0.1001對所有樣品的全部有效數(shù)據(jù)進行聚類，默認以97%的一致性(identity)將序列聚類成為操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)，同時會選取OTU的代表性序列，依據(jù)其算法原則，篩選OTU中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為代表序列；對OTU序列進行物種注釋，用Mothur方法與SILVA132[10]的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進行物種注釋分析(設定閾值為0.8～1.0)，獲得分類學信息并分別在各個分類水平：kingdom(界)，phylum(門)，class(綱)，order(目)，family(科)，genus(屬)，species(種)統(tǒng)計各樣本的群落組成；使用MUSCLE v3.8.31軟件進行快速多序列比對，得到所有OTU序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系[11]。最后對各樣品的數(shù)據(jù)進行均一化處理，后續(xù)分析都是基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 測序數(shù)據(jù)分析

16S rDNA擴增子測序得到的有效數(shù)據(jù)數(shù)目在45 878～64 178范圍內(nèi)，平均長度395～415 nt，有效數(shù)據(jù)中堿基質(zhì)量值大于20(測序錯誤率小于1%)的堿基所占的百分比(Q20)超過82%，數(shù)據(jù)得率90%以上。3個樣本組的測序深度均超過99.9%，理論上測序數(shù)據(jù)已覆蓋樣本中的全部序列。

2.2 OTUs聚類分析

在97%相似性水平上進行聚類，3個樣本組共有OTU數(shù)量達1015個，樣本組JN6，JN9和JN12特有的OTU數(shù)量分別為303，484和274個(圖1)?；贠TU的物種分類分析，細菌種類覆蓋31個門725個屬。其中，樣本組JN9中特有的OTU數(shù)目最多，預示含有較多的特有微生物種類。

圖1 OTU維恩圖Fig.1 Venn diagram of OTU

2.3 門水平Top10物種相對豐度及優(yōu)勢物種差異分析

對OTU的代表序列進行物種注釋，根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取3個樣本組在門(phylum)分類水平上最大豐度排名前10的物種進行物種相對豐度和優(yōu)勢物種差異分析(圖2)，結(jié)果顯示各樣本中以變形菌門(Proteobacteria)(占比27%～54%)、厚壁菌門(Firmicutes)(占比13%～30%)、放線菌門(Actinobacteria)(占比12%～30%)和擬桿菌門(Bacteroidetes)(占比4%～10%)的微生物居多，4種細菌門總豐度平均為90%。許多對人體有害的微生物如大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、幽門螺桿菌、腦膜膿毒性金黃桿菌、結(jié)核分枝桿菌和麻風分枝桿菌等都屬于這些種類[12-13]。在生活環(huán)境中，變形菌門細菌比較常見，即使經(jīng)過消毒殺菌，其再生能力仍然較強[14]。厚壁菌門細菌即使處于一些抗生素環(huán)境中也具有較強的生命力[15]。放線菌中絕大多數(shù)是有益菌，也有極少數(shù)會引起人類的疾病。擬桿菌門的一些細菌可以釋放細胞神經(jīng)毒素從而使人體發(fā)生炎癥性神經(jīng)變性，甚至已經(jīng)可以作為某些環(huán)境下的污染指標[16-17]。隨著使用時間的增加，3個樣本組中變形菌門、厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門這4類菌之間的豐度比例相對變化不明顯，但總豐度由85%上升至95%，分析可能是該地區(qū)空氣中微生物群落結(jié)構(gòu)長期變化不大，且持續(xù)污染程度較嚴重，使得空氣中微生物含量豐富導致的這種現(xiàn)象，所以該地區(qū)室內(nèi)新風空氣凈化系統(tǒng)濾膜中致病菌存在的可能性較大，可能會出現(xiàn)微生物的二次污染情況。

圖2 門水平上Top10物種相對豐度柱形圖Fig. 2 Bar chart of relative abundance of top 10 species at phylum level

2.4 屬水平Top100物種系統(tǒng)進化關(guān)系及Top10物種相對豐度分析

變形菌門、放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門中所含菌屬種類明顯居多(圖3)。在3個樣本組中，甲基桿菌屬(Methylobacterium)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、副球菌屬(Paracoccus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、萊茵海默氏菌屬(Rheinheimera)、不動桿菌屬(Acinetobacter)和藍細菌屬等為優(yōu)勢菌屬(圖3)。其中，甲基桿菌屬、雙歧桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、芽孢桿菌屬、不確定藍細菌屬的微生物一般是室內(nèi)經(jīng)常檢出的優(yōu)勢菌群[18]。此外，樣本組JN12中還特別富含萊茵海默氏菌屬、乳桿菌屬(Lactobacillus)和不動桿菌屬的微生物(圖4)。其中不動桿菌屬中一些微生物是條件致病菌，如鮑曼不動桿菌，該菌是臨床上最常見的一種條件致病菌，通常會引起腹膜炎、骨髓炎、關(guān)節(jié)炎、菌血癥和肺炎等[19]。Wu等[20]利用16S rDNA高通量測序技術(shù)對奶粉生產(chǎn)線室內(nèi)空氣進行了微生物多樣性檢測，也發(fā)現(xiàn)鮑曼不動桿菌、蠟樣芽胞桿菌、科氏葡萄球菌等一些致病菌。由于JN12中不動桿菌屬微生物占有較高的豐度，因此推測該地區(qū)的空氣凈化系統(tǒng)在使用12個月時存在微生物二次污染的風險，應當引起居民的注意。

圖3 屬水平上Top10物種相對豐度柱形圖Fig. 3 Bar chart of relative abundance of top10 species at genus level

分支和扇形的顏色表示其對應的門；扇環(huán)外側(cè)的堆積柱形圖表示該菌屬在不同樣本中的豐度分布信息。圖4 屬水平Top100物種系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系Fig.4 Top100 species phylogenetic relationships at genus level

2.5 不同使用時間對優(yōu)勢物種的影響

通過分析3組樣本組之間的優(yōu)勢菌屬和種的差異(圖5)，我們在屬和種分類水平下，選取平均豐度排名前10的物種，生成三元相圖(ternary plot)。由圖5(a)可知，隨著空氣濾膜使用時間的延長，微生物的菌屬優(yōu)勢也在發(fā)生變化，逐漸由不確定藍細菌屬、雙歧桿菌屬和鞘氨醇單胞菌屬向芽孢桿菌屬、副球菌屬過渡，最后不動桿菌屬和萊茵海默氏菌屬微生物占絕對優(yōu)勢。在種水平上(圖5(b))，從使用時間6個月到12個月，由Loliumperenne，Methylobacteriumaquaticum，Bambusaoldhamii和Pelomonaspuraquae向Sphingomonasphyllosphaerae，Bifidobacteriumadolescentis，Moraxellaosloensis，Clostridiumpapyrosolvens和Kocuriarosea過渡，最后Acinetobacterjohnsonii占絕對優(yōu)勢。其中，使用時間為9個月的樣本中含有奧斯陸莫拉氏菌(Moraxellaosloensis)。該菌為條件致病菌，可引起臨床上原發(fā)性和繼發(fā)性感染，如結(jié)膜炎、中耳炎、腦膜炎、腎炎、支氣管炎和關(guān)節(jié)炎等[12,21]。以上結(jié)果預示著該地區(qū)的室內(nèi)空氣中存在著一些致病菌，通過新風空氣凈化系統(tǒng)過濾后累積于濾膜上，若濾膜的使用時間過長，容易發(fā)生微生物二次污染，影響居民的身體健康。

圖5 樣本的優(yōu)勢屬和種的差異Fig. 5 Differences of dominan tgenus and species in samples

3 結(jié)論

采用高通量測序技術(shù)對樣本16S rDNA片段進行測序，可以獲得準確的序列信息和更大的數(shù)據(jù)量，從而在后續(xù)分析中獲得更加深入、全面和可靠的結(jié)果。將此技術(shù)引入室內(nèi)空氣凈化系統(tǒng)的細菌多樣性分析中，可以提供更加詳實準確的信息。通過分析濟南市歷城地區(qū)室內(nèi)新風凈化系統(tǒng)隨著使用時間的延長室內(nèi)空氣中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)室內(nèi)空氣中微生物含量較豐富，群落結(jié)構(gòu)長期變化不大，并且空氣中存在條件致病菌，如奧斯陸莫拉氏菌等。該地區(qū)室內(nèi)新風空氣凈化系統(tǒng)使用12個月時存在一定的微生物二次污染風險。