魏 丹, 國 明, 張 菊

(1. 河北經(jīng)貿(mào)大學生物科學與工程學院, 河北 石家莊 050000; 2. 浙江省化工研究院有限公司分析測試中心, 浙江 杭州 310000)

氟喹諾酮類藥物(fluoroquinolones, FQs)作為一類人工合成的抗菌藥,具有廣譜、高效、殺菌能力強、低毒等特點,已廣泛用于水產(chǎn)、畜牧養(yǎng)殖業(yè)中動物疾病的預(yù)防和治療。由于氟喹諾酮藥物在養(yǎng)殖過程中的不合理使用和濫用,在食品中殘留累積量呈遞增趨勢,對人類的健康造成潛在的風險。我國規(guī)定動物肌肉組織中氟喹諾酮類藥物最大殘留限量為10～500 μg/kg[1];自2015年,我國禁止在食用動物中使用培氟沙星、洛美沙星、諾氟沙星和氧氟沙星4類氟喹諾酮類抗生素。因此,建立水產(chǎn)品多種氟喹諾酮類藥物殘留的可靠檢測方法,對保證動物源性食品安全具有積極意義。

目前,氟喹諾酮類藥物殘留的檢測方法主要有毛細管電泳法(capillary electrophoresis, CE)[2,3]、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)[4,5]和高效液相色譜-質(zhì)譜法(high performance liquid chromatography-mass spectrometry, HPLC-MS)[6,7]等。HPLC和HPLC-MS在氟喹諾酮殘留檢測中廣泛應(yīng)用;其中,HPLC-MS結(jié)合了液相色譜的高分離能力和質(zhì)譜高分辨率的檢測能力,具有準確度高、靈敏度高、特異性和選擇性強的特點,適用于喹諾酮類藥物同時快速測定[8]。目前用于HPLC-MS/MS的樣品前處理方法主要有加速溶劑萃取(accelerated solvent extraction, ASE)[9]、固相萃取(solid phase extraction, SPE)[10]、QuEChERS[11]和磁固相萃取(magnetic solid phase extraction, MSPE)[12]等。QuEChERS雖然操作簡便,分析速度快,但是由于缺少了吸附洗脫這一過程,其凈化效果弱于SPE。傳統(tǒng)的SPE操作較為繁瑣,MSPE作為一種新型SPE,具有操作簡便、分離時間短,有機溶劑用量少等優(yōu)點。然而,MSPE難以對固體樣品中的目標分析物進行直接萃取。ASE具有溶劑消耗少、操作自動化程度高、提取充分、速度快等優(yōu)點,適用于固體樣品中的有機污染物的檢測中[13],但其凈化效果較差。

鑒于上述問題,本研究將ASE與MSPE相結(jié)合,建立了ASE-MSPE-HPLC-MS/MS同時檢測水產(chǎn)品中10種氟喹諾酮類藥物殘留的分析方法,與單純的ASE相比較,凈化效果更為顯著;與目前常用的SPE和QuECHERS凈化方法相比較,ASE萃取液通過MSPE凈化,保留了ASE和MSPE的優(yōu)點,具有操作簡便快速、有機溶劑用量少且不需要置換萃取溶劑等優(yōu)點。該方法提取充分,凈化效果良好,有效解決了固體樣品基質(zhì)效應(yīng)導(dǎo)致的回收率低的問題,可以滿足水產(chǎn)品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測的要求。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1290 infinity高效液相色譜-6460 TripleQuad質(zhì)譜儀(帶自動進樣器,美國Agilent公司); ZORBAX EclipsePlus C18(100 mm×3.0 mm, 1.8 μm,美國Agilent公司); Milli-Q超純水器(美國Millipore公司); 0.22 μm微孔濾膜(上海安譜科學儀器有限公司); KQ-100DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); SevenEasyS30型pH計(瑞士梅特勒-托利多公司); S-4700型場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)(日本Hitachi公司);傅里葉變換紅外光譜分析儀(FTIR)(德國Bruker公司)。

10種氟喹諾酮標準物質(zhì):沙拉沙星(sarafloxacin, SAR);氧氟沙星(ofloxacin, OFL);恩諾沙星(enrofloxacin, ENR);丹氟沙星(danofloxacin, DAN);洛美沙星(lomefloxacin, LOM);培氟沙星(pefloxacin, PEF);環(huán)丙沙星(ciprofloxacin, CIP);依諾沙星(enoxacin, ENO);諾氟沙星(norfloxacin, NOR);雙氟沙星(difloxacin, DIF);購于德國Dr. Ehrenstorfer公司。甲醇、乙腈均為色譜純(美國Sigma-Aldrich公司);二氯甲烷、乙酸、氨水、乙酸銨等為分析純,購自杭州雙林化工試劑廠;實驗用水為超純水(電阻率≥18.2 MΩ·cm),由Millipore超純水發(fā)生器產(chǎn)生。

納米零價鐵(nZVI,純度>99.5%)(深圳微納科技有限公司);氧化石墨烯(GO,純度>99%)(南京先豐納米材料科技有限公司)。

黃魚、草魚、黑魚、明蝦和沼蝦為本地市售。

1.2 溶液配制

準確稱取10種氟喹諾酮各0.100 0 g于100 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容,得到1 g/L標準儲備溶液,然后存于4 ℃冰箱內(nèi)避光保存。使用時,以空白基質(zhì)提取液稀釋成系列濃度的混合基質(zhì)匹配標準工作溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 磁性凈化材料的制備及表征

磁性復(fù)合材料(GO@nZVI)的制備采用室溫溶劑自組裝法[14]。首先配制GO儲備液:準確稱取適量的GO,在水中超聲分散15 min,配制成1 g/L的GO儲備液。在25 ℃下將1.000 g nZVI加入10 mL去離子水中,超聲15 min。然后加入50 mL的GO儲備液,渦旋振蕩30 s。最終生成黑色沉淀,使用磁鐵分離凈化,上清液為澄清液體,收集的沉淀物為GO@nZVI磁性復(fù)合材料,作為MSPE凈化材料。

1.4 樣品前處理

1.4.1樣品采集及處理

將魚去皮、去骨、去鱗,取肌肉組織;蝦去殼、去頭,取肌肉部分。經(jīng)粉碎機粉碎后勻漿,放入-38 ℃的高低溫試驗箱進行4 h預(yù)冷凍,然后用真空冷凍干燥儀對樣品進行脫水,凍干后充分研磨,過20目篩。

1.4.2ASE萃取

稱取處理后的樣品10.00 g,與適量硅藻土放入玻璃研缽中,摻拌均勻并研磨后裝入34 mL萃取池(用硅藻土填滿池內(nèi)空隙),進行加速溶劑萃取。萃取溶劑為甲醇,萃取溫度為70 ℃,萃取壓力為10.34 MPa,靜態(tài)萃取時間為5 min,循環(huán)萃取3次,沖洗體積為60%萃取池體積,氮氣吹掃120 s。收集全部萃取液,40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近2 mL,用少量甲醇將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶底部沖洗2次,合并全部的濃縮液至10 mL的試管里,氮吹至近干,用去離子水定容至1.0 mL,待凈化。

1.4.3MSPE凈化

將上述樣品溶液放入10.0 mL試管中,加入10 mg的GO@nZVI磁性材料,渦旋振蕩5 min,利用磁鐵將吸附了氟喹諾酮類藥物的磁性材料分離,收集在試管底部,棄去上清液。加入0.5 mL純氨水超聲10 min進行洗脫,洗脫溶液在氮氣下吹干,然后再溶解于100 μL甲醇中,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后取10 μL,進行HPLC-MS/MS定量分析。ASE-MSPE萃取流程如圖1所示。

圖 1 ASE-MSPE萃取流程圖Fig. 1 Diagram of accelerated solvent extraction-magnetic solid phase extraction (ASE-MSPE) extraction GO: graphene oxide; nZVI: nanoscale zero valent iron; GO@nZVI: graphene oxide coated nanoscale zero valent iron.

1.5 儀器條件

液相色譜條件:Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(100 mm×3.0 mm, 1.8 μm);柱溫:35 ℃,流速:0.3 mL/min;流動相A為0.1%(v/v)甲酸水溶液,B為0.1%(v/v)甲酸甲醇溶液。梯度洗脫程序為:0 min (10%B)～1 min (10%B)～7 min (40%B)～10 min (60%B)～11 min (90%B)～12 min (10%B)。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子化(ESI)源,正離子檢測模式;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式進行定量分析。干燥氣(N2)溫度為300 ℃,流速為5 L/min;霧化氣(N2)壓力為310 kPa;鞘氣(N2)溫度為250 ℃,流速為10 L/min;毛細管電壓為3 500 V,噴嘴電壓為0 V。10種氟喹諾酮的質(zhì)譜參數(shù)見表1, MRM譜圖見圖2。

2 結(jié)果與分析

2.1 ASE萃取條件的優(yōu)化

萃取溶劑是影響ASE萃取效率的重要因素之一。由于大多數(shù)氟喹諾酮類藥物為極性化合物,含有氨基和羧基,易溶于水溶液和乙腈,在參考文獻[15-18]基礎(chǔ)上,比較了2%(v/v)乙酸乙腈、乙腈、pH 7磷酸二氫鉀緩沖溶液3種萃取溶劑對10種氟喹諾酮類藥物萃取效果。選擇乙腈作提取劑時,10種氟喹諾酮類藥物的回收率在62.5%～78.1%之間,萃取液較混濁,可能由于樣品基質(zhì)中提取出來的內(nèi)源有機物較多。磷酸緩沖鹽(pH=7)和2%(v/v)乙酸乙腈提取率較好。以磷酸緩沖鹽(pH=7)作萃取劑時,10種氟喹諾酮類藥物的回收率在80.6%～93.2%之間,但是磷酸緩沖鹽提取液呈膠狀,這可能由于水產(chǎn)品的蛋白質(zhì)含量較高,水溶性蛋白質(zhì)使萃取液呈膠狀;以2%(v/v)乙酸乙腈作萃取劑時,10種氟喹諾酮類藥物的回收率為76.2%～98.5%,雜質(zhì)干擾最少,可能由于有機溶劑和水溶液的混合溶劑在一定程度上提高了萃取選擇性,減少了雜質(zhì)的干擾。通過比較不同萃取劑的萃取回收率和提取液的雜質(zhì)干擾程度,最終選擇2%(v/v)酸化乙腈作為ASE萃取劑。

表 1 10種氟喹諾酮類藥物的質(zhì)譜參數(shù)

圖 2 10種氟喹諾酮的MRM譜圖Fig. 2 MRM spectrum of the 10 fluroquinolones

采用正交試驗考察了萃取溫度(50、70、100 ℃)、萃取時間(2、5、8 min)和循環(huán)次數(shù)(1、3、5次)3個影響因素在3個水平下對10種氟喹諾酮類藥物的提取效率。在空白樣品中加入1.0 μg/kg的氟喹諾酮類藥物混合標準溶液,根據(jù)L9(33)正交試驗表進行試驗,每個因素設(shè)計3個水平,平行3次試驗,萃取壓力為10.34 MPa,氮氣吹掃時間為120 s,沖洗體積為60%。極差(R)分析結(jié)果顯示,各因素對不同目標物影響的主次順序為:萃取溫度(A)>萃取時間(B)>萃取循環(huán)次數(shù)(C)。最顯著影響因素為萃取溫度,根據(jù)表2中各因素k值(各因素水平目標物平均回收率的平均值),得到最優(yōu)組合為A2B2C2,即萃取溫度為70 ℃,萃取時間為5 min,循環(huán)次數(shù)為3次。

表 2 ASE條件正交試驗設(shè)計及結(jié)果

由于水產(chǎn)品樣品基質(zhì)復(fù)雜,為減小基質(zhì)干擾,樣品經(jīng)ASE萃取后再進一步采用MSPE凈化。制備對目標物具有高選擇吸附能力的磁性凈化材料至關(guān)重要,可降低基體干擾,提高分析靈敏度。nZVI具有納米級粒徑、大比表面積、反應(yīng)活性高、價廉易得等優(yōu)點[19-21]。由于易被氧化、沉淀,非常細小的nZVI常會發(fā)生團聚,導(dǎo)致其有效比表面積明顯降低,從而大大降低了吸附活性。為此,可以通過選擇合適的碳材料,將nZVI材料負載到不同的碳材料表面,制備nZVI與碳材料的復(fù)合物以提高吸附效率。GO含有豐富的含氧官能團,如羥基、羧基、羰基和環(huán)氧基等,具有超高比表面積、良好的穩(wěn)定性、良好的親水性、分散性和生物相容性、大共軛體系,可以有效吸附與富集氟喹諾酮類抗生素殘留[22,23]。本文采用室溫自組裝法制備GO@nZVI磁性復(fù)合材料,相較于其他的磁性材料制備方法,GO@nZVI的制備過程操作簡單快速、條件溫和,僅需要在室溫條件下調(diào)節(jié)溶液的pH, GO和nZVI可以在靜電引力、π-π相互和氫鍵等作用力下快速結(jié)合。同時,制備所得磁性凈化復(fù)合材料GO@nZVI通過靜電引力、π-π相互和氫鍵等作用力選擇性萃取和富集氟喹諾酮類藥物,實現(xiàn)進一步凈化ASE萃取液的目的,提高檢測結(jié)果的準確性。

2.2.1磁性凈化材料的表征

通過掃描電鏡、傅里葉變換紅外光譜和X-射線衍射對GO、nZVI和GO@nZVI磁性復(fù)合物進行了表征。由圖3a可知,GO@nZVI磁性復(fù)合物的掃描電鏡圖中,GO@nZVI粒徑約100～500 nm, nZVI被GO片層結(jié)構(gòu)附著后出現(xiàn)團聚,形成蓬松結(jié)構(gòu),表面粗糙,證明GO@nZVI磁性復(fù)合物自組裝成功。GO@nZVI的傅里葉變換紅外光譜圖(見圖3b)中含有與nZVI相同的特征峰,而GO的特征峰(-COOH, 1 725 cm-1; C-O-C, 1 224 cm-1; C-OH, 1 042 cm-1)消失,表明GO通過氫鍵、靜電作用力等方式緊密地附著于nZVI的表面,形成GO@nZVI。如圖3c所示,GO@nZVI的X-射線衍射譜圖中含有與nZVI相同的特征衍射峰,GO中特征衍射峰消失,進一步證明了GO@nZVI是通過氫鍵、靜電作用力等自組裝方式復(fù)合而成。

2.2.2MSPE條件的優(yōu)化

使用10 mL的空白加標樣品基質(zhì)ASE萃取液,比較了GO@nZVI用量、吸附時間、洗脫劑、洗脫劑體積和洗脫時間對10種氟喹諾酮類藥物的凈化效果,平行測定3次。如圖4所示,GO@nZVI的最優(yōu)用量為10 mg,此時FQs的萃取效率達到最大,繼續(xù)增加用量后基本保持穩(wěn)定;吸附時間為5 min時,大多數(shù)目標物回收率較好;相比較于甲醇、去離子水、氨水溶液(pH 9、11、12),純氨水的洗脫效果最好。這可能是由于氟喹諾酮類藥物為兩性分子,易溶于堿性溶液且呈負離子模式,隨著pH的增大,與GO@nZVI間靜電斥力作用不斷增加,氫鍵作用減弱,使FQs易于從GO@nZVI洗脫下來。進一步考察了洗脫時間(5～15 min)對10種氟喹諾酮類藥物回收率的影響。結(jié)果表明優(yōu)化的條件為:GO@nZVI用量為10 mg,吸附時間為5 min,以純氨水作為洗脫溶劑(0.5 mL),洗脫時間為10 min。

圖 3 GO、nZVI和GO@nZVI的(a)SEM圖、(b)FT-IR譜圖和(c)XRD譜圖Fig. 3 (a) Scanning electron microscopy (SEM) images, (b) Fourier transform infrared (FT-IR) spectra and (c) X-rays diffraction (XRD) patterns of GO, nZVI and GO@nZVI

圖 4 (a)磁性材料GO@nZVI用量、(b)萃取時間、(c)洗脫劑種類和(d)洗脫時間對MSPE萃取效率的影響(n=3)Fig. 4 Effect of (a) GO@nZVI amount, (b) extraction time, (c) type of desorption solvent and (d) desorption time on magnetic solid-phase extraction (MSPE) efficiency (n=3)

2.3 方法驗證

配制10種FQs的混合基質(zhì)匹配標準溶液,含量分別為1.0、2.0、5.0、10、50、100 μg/kg,在最優(yōu)條件下進行ASE-MSPE-HPLC-MS/MS分析,得到各目標物的線性方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明,在1～100 μg/kg范圍內(nèi),10種FQs呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.999 5。以3倍和10倍信噪比(S/N)確定檢出限(LOD)和定量限(LOQ),分別為0.02～0.29 μg/kg和0.07～0.98 μg/kg(見表3),低于我國規(guī)定的最大殘留限量要求,滿足實際檢測需要。

表 3 10種氟喹諾酮抗生素的檢出限、定量限、空白加標回收率和相對標準偏差(n=5)

為了考察方法的準確度和精密度,以1倍、2倍、10倍定量限3個添加水平的空白樣品進行了加標回收率和RSD的測定,每個水平單獨測定6次,回收率的范圍在81.6%～105.8%, RSD<13.6%,說明方法具有良好的準確度和精密度。

為了進一步驗證本方法的準確度,采用本方法和國標法[24]同時測定同一陽性樣品(黃魚),兩種方法分別平行測定5次。以國標法測定的黃魚中培氟沙星的含量平均值(0.94 μg/kg)作為已知值,本方法培氟沙星的5次測定值分別為1.02、1.14、0.96、0.92和1.01 μg/kg。用t檢驗法將測定的平均值與已知值進行比較,t測定=1.89,小于t(0.95, n=5)=2.57,說明本方法與國標方法無顯著性差異,進一步證明了方法的可靠性和準確性。

表 4 本方法與文獻中氟喹諾酮檢測方法的比較

將本方法與文獻報道的其他前處理技術(shù)結(jié)合高效液相色譜檢測氟喹諾酮類抗生素藥物殘留的結(jié)果進行比較,其中萃取時間不包括氮吹處理樣品的時間,結(jié)果見表4。Stoilova等[4]建立了固相萃取-高效液相色譜-熒光法,檢測了牛奶樣品中9種喹諾酮藥物殘留,采用液液萃取,通過離心方式進行去蛋白質(zhì)預(yù)處理,再使用HLB固相萃取小柱進行萃取凈化,檢出限為3～50 μg/kg,該方法的樣品前處理時間較長。趙娜等[11]建立了QuEChERS-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,同時測定有機肥料中10種氟喹諾酮,以酸化乙腈(pH=4.0)為提取劑,經(jīng)渦旋混合、超聲提取,離心分離完成對有機肥料中10種氟喹諾酮的萃取,方法檢出限為0.5～2.5 μg/kg,萃取時間為17 min,相對于本方法萃取時間較短,但是單純QuEChERS方法萃取的凈化效果可能較不理想。王成真等[27]建立了液液萃取-高效液相色譜-熒光法,檢測雞蛋中5種氟喹諾酮藥物殘留,該方法檢出限為0.2～4 μg/kg,樣品經(jīng)乙腈沉淀蛋白質(zhì),正己烷脫脂,離心分離,上清液后高效液相色譜儀分析。劉艷麗等[12]建立了磁分散固相萃取-高效液相色譜-熒光法,檢測牛奶中5種禁用的氟喹諾酮藥物殘留,方法檢出限為1～4 ng/L,采用一步溶劑熱法合成了磁性還原氧化石墨烯材料,制備時間>30 min,以磁性材料作為吸附劑,避免了離心過程,萃取時間為16 min,大大縮短了試驗時間,但此方法不適合固體樣品,且相比于溶劑熱法制備,本研究采用室溫溶劑制備法,操作更加簡單快速。與文獻報道方法相比,在回收率相當?shù)那闆r下,本方法的方法檢出限低(0.02～0.29 μg/kg),萃取步驟自動化程度高,且只需在外加磁場作用下即可完成對水產(chǎn)品中10種氟喹諾酮萃取液凈化,無需離心和過濾。同樣品基質(zhì)相同或相似的檢測方法比較,本方法操作簡單快速,萃取溶劑使用較少,所使用磁性萃取材料制備方法簡單,使用有機溶劑少,適合水產(chǎn)品中痕量氟喹諾酮殘留的檢測。

2.5 實際樣品測定

選取市售黃魚、草魚、黑魚、明蝦和沼蝦5種水產(chǎn)品,采用所建立的方法,按照最優(yōu)實驗條件,進行10種氟喹諾酮類藥物殘留的檢測。檢測結(jié)果顯示:黃魚中培氟沙星的殘留量為1.01 μg/kg;黃魚、草魚、明蝦和沼蝦中恩諾沙星的殘留量分別為5.16、8.56、1.22和8.07 μg/kg,均低于水產(chǎn)品中氟喹諾酮最大殘留限量(10～100 μg/kg)[1];黃魚和黑魚中檢出禁用氧氟沙星,殘留量為1.18、2.59 μg/kg。

3 結(jié)論

本文建立了測定水產(chǎn)品中10種FQs殘留的加速溶劑萃取-磁固相萃取凈化-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。該方法具有操作簡便快速、使用溶劑較少、方法靈敏度高、準確度高、重復(fù)性好等特點,可滿足我國國家標準中對水產(chǎn)品中FQs限量檢測要求,具有實際的應(yīng)用前景。