喬勇升, 王俊虎, 仇雅靜, 錢忠義, 胡 慧, 陳 偉, 王 萍

(泰州市食品藥品檢驗所, 江蘇 泰州 225300)

茶是世界上廣受歡迎的消費飲料。由于茶多酚、咖啡因和氨基酸等許多功能性成分的存在,茶對人類健康具有廣泛的益處[1,2]。但是,茶樹在種植和生長中不可避免地要使用農(nóng)藥來保護自身免受雜草、真菌或昆蟲的侵害[3],這些農(nóng)藥化合物的殘留可以通過食物鏈進行積累和放大,如果超過一定水平,將會增加對人類健康造成損害的風(fēng)險[4]。各國政府和國際機構(gòu)對合法授權(quán)的各種農(nóng)藥化合物的最大殘留限量(MRLs)制定了嚴格的法規(guī)[5]。這些法規(guī)被視為貿(mào)易標準,以確保進出口食品、食用農(nóng)產(chǎn)品的消費安全,降低對健康造成危害的風(fēng)險。但是法規(guī)規(guī)定的有害化合物數(shù)量有限,評估各類農(nóng)藥在食品的生產(chǎn)、加工及流通等環(huán)節(jié)的暴露風(fēng)險迫在眉睫。因此,在最短的時間內(nèi),以合理的成本通過一次分析獲得樣品中盡可能多的農(nóng)藥殘留信息,對于檢驗實驗室來說變得越來越重要。

大多數(shù)用于監(jiān)控農(nóng)藥殘留的分析方法依賴于氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)[6-8]。由于極性、非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定等因素[9],液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),特別是聯(lián)用三重四極桿質(zhì)譜儀被認為是分析各種基質(zhì)中農(nóng)藥殘留最廣泛應(yīng)用的技術(shù)。但是這些方法在一次運行中監(jiān)控的化合物數(shù)量有限,并且為了準確定性和定量,必須獲得大量的參考標準物質(zhì),預(yù)設(shè)置質(zhì)譜采集參數(shù)。同時意味著它不能檢測樣品中存在但前期未設(shè)置采集參數(shù)的化學(xué)污染物。因此,針對有毒害的化學(xué)污染物質(zhì)大規(guī)模的定向或非定向篩查,迫切需要引入新技術(shù)。

高分辨率質(zhì)譜(HRMS)憑借質(zhì)量范圍廣、分辨率和質(zhì)量精度高、分析速度快等特點,現(xiàn)已成為檢驗檢測擴大分析范圍和降低錯誤率的首選。其主要優(yōu)點之一是能夠以全掃描模式記錄無限數(shù)量的化合物,使回顧性分析成為可能。并且由于高分辨率、高靈敏性等數(shù)據(jù)采集特性,HRMS可以對沒有參考標準的化合物進行定性篩查分析。質(zhì)譜儀的數(shù)據(jù)獲取方式包括信息依賴型數(shù)據(jù)采集模式(data dependent acquisition, DDA)與非信息依賴型數(shù)據(jù)采集模式(data independent acquisition, DIA),其中DIA模式是指不需對樣品中的化合物進行預(yù)選擇,而是采集所有從色譜中分離出的化合物質(zhì)譜信息。目前應(yīng)用最多的是Waters公司開發(fā)的MSE掃描模式和Thermo Fisher公司軌道離子阱Orbitrap儀器中的全離子碎片掃描模式(AIF)[5]?；赒TOF-MS/MS技術(shù)的MSE全信息串聯(lián)質(zhì)譜采集模式,僅需運行一次分析,即可記錄所有化合物信息,包括高質(zhì)量精度的母離子及其碎片離子信息等,從而極大地提高了篩查效率和準確度,特別適合用于定向和非定向篩查與鑒定復(fù)雜樣品中的有毒有害化合物[6-13]。

茶葉是一種基質(zhì)成分復(fù)雜的樣品,本文探索建立針對茶葉樣品的大規(guī)模定向篩查檢測方法。通過對購置的農(nóng)藥認證標準物質(zhì)(CRM)分析,建立農(nóng)藥質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。以固相萃取法為凈化手段,采用高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-QTOF-MS)結(jié)合UNIFI軟件進行篩查分析。進行定性方法學(xué)驗證,確定每種農(nóng)藥在茶葉樣品中的篩查檢出限(SDL)。最后,應(yīng)用建立的方法分析了流通市場上部分茶葉的農(nóng)藥殘留情況。本文建立的方法快速、準確、符合成本效益,適用于茶葉中農(nóng)藥殘留快速篩查分析,也為化學(xué)污染物殘留的高通量篩查檢測提供了參考。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Xevo G2-QTOF四極桿飛行時間質(zhì)譜儀、Acquity UPLC超高效液相色譜儀、MassLynx V4.1數(shù)據(jù)處理操作平臺,UNIFI 1.7.0科學(xué)信息學(xué)系統(tǒng)(美國Waters公司); Allegra 64R臺式冷凍高速離心機(美國Beckman Coulter公司); Milli-Q Reference超純水機(美國Millipore公司); XS204型電子分析天平,感量為0.000 01 g(瑞士Mettler Toledo公司); JP-100超聲波清洗器(深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司)。Cleanert TPT(Triple Phase of Tea SPE)茶葉農(nóng)殘檢測專用固相萃取柱(1 g/6 mL,天津Agela公司)

農(nóng)藥混合標準物質(zhì)(批號CRM42227(含30種農(nóng)藥)、CRM42202(含33種農(nóng)藥)、CRM42230(含21種農(nóng)藥)、CRM42209(含28種農(nóng)藥),濃度均為100 μg/mL,溶劑為乙腈,Sigma-Aldrich貿(mào)易有限公司)均為認證標準物質(zhì)。甲醇、乙腈均為色譜純(西班牙Scharlau公司),甲苯為色譜純(美國Tedia公司),乙酸、乙酸銨均為LC-MS級試劑(美國Anaqua公司)、無水硫酸鈉為分析純(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。尼龍66針式濾膜(0.22 μm,天津津騰公司)。氮氣、氬氣(>99.999%)。實驗用水由Milli-Q超純水機制備。

樣品來源與準備:茶葉樣品從流通市場抽取采集,種類包括綠茶、紅茶、白茶、烏龍茶、普洱茶等。樣品采集后即密封置于4 ℃冰箱中,實驗前放至室溫粉碎。

1.2 儀器分析條件

1.2.1UPLC-QTOF-MS條件

UPLC條件 色譜柱Waters Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱溫45 ℃;流動相A為10 mmol/L乙酸銨溶液(pH 5.0),流動相B為含10 mmol/L乙酸銨的甲醇。洗脫程序:0～0.25 min, 2%B; 0.25～12.25 min, 2%B～99%B; 12.25～13.00 min, 99%B; 13.00～13.01 min, 99%B～2%B; 13.01～15.00 min, 2%B。流速為0.40 mL/min;樣品進樣量為10 μL。

QTOF-MS條件 離子源溫度:120 ℃;脫溶劑氣溫度:550 ℃;脫溶劑氣流速:1 000 L/h;錐孔氣流速:50 L/h;毛細管電壓:0.8 kV;錐孔電壓:20 V;電離模式:ESI正離子模式;掃描模式:分辨率模式。采集模式:MSE模式;質(zhì)量掃描范圍:m/z50～1 200;掃描時間:0.1 s;碰撞能量:低碰撞能量(LE)為4 eV,高碰撞能量(HE)為10～45 eV。LockSpray溶液:亮氨酸腦啡肽(m/z556.277 1),掃描時間0.1 s,間隔30 s。數(shù)據(jù)的采集通過MassLynx V4.1數(shù)據(jù)處理操作平臺完成。

1.2.2UNIFI軟件篩查條件

高能量下響應(yīng)閾值:20.0；低能量下響應(yīng)閾值:100.0;背景噪聲過濾強度:高;保留時間最大偏差:0.1 min;精確質(zhì)量偏差閾值:5×10-6;可識別的化合物加合峰形式包括+H、+Na、+K、+NH4峰。碎片(同位素、加合物)質(zhì)量偏差閾值:10 mDa。

1.3 實驗步驟

1.3.1農(nóng)藥質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的建立

采用UPLC-QTOF-MS對農(nóng)藥化合物的混合標準溶液(2.0 mg/L)進行分析,在MSE模式下從低碰撞能量掃描獲得質(zhì)子化分子、相應(yīng)同位素及加合物的信息,從高碰撞能量掃描獲得主要碎片離子信息。MassLynx軟件采集精確質(zhì)量數(shù)、保留時間等數(shù)據(jù)。將每個化合物的名稱、分子式、精確質(zhì)量數(shù)、保留時間、碎片離子、同位素及加合物等信息制成Excel表格,合并各個化合物結(jié)構(gòu)式的mol文件導(dǎo)入UNIFI軟件,構(gòu)建農(nóng)藥化合物質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。

1.3.2樣品前處理

稱取粉碎后的試樣10 g(精確至0.01 g)于50 mL具塞離心管中,加人30 mL乙腈溶液,在均質(zhì)機上以15 000 r/min均質(zhì)1 min, 4 200 r/min離心5 min,收集上清液。殘渣重復(fù)提取一次,合并上清液入雞心瓶中,45 ℃旋蒸至近干,加入1 mL乙腈溶解殘余物,待凈化。

在Cleanet TPT柱中加入約2 cm高無水硫酸鈉,并用5 mL乙腈-甲苯(3∶1, v/v)活化固相萃取柱,液面達硫酸鈉頂部時,加入樣品提取液并收集流出物。以25 mL乙腈-甲苯(3∶1, v/v)洗脫目標物,合并洗脫液,45 ℃旋蒸至近干,以1 mL初始流動相溶解殘渣,0.2 μm微孔濾膜過濾后供儀器測定。

1.3.3農(nóng)藥化合物的篩查與鑒定

凈化處理后的樣品在1.2.1節(jié)條件下分析,將采集的數(shù)據(jù)導(dǎo)入UNIFI軟件進行自動譜峰匹配識別,與自建的農(nóng)藥數(shù)據(jù)庫完成比對。篩查參數(shù)如保留時間、精確質(zhì)量數(shù)的設(shè)置參考SANTE/11813/2017指南《食品和飼料中農(nóng)藥殘留分析的方法驗證和質(zhì)量控制程序》[14]。對篩查檢測給出的可疑陽性化合物進行人工鑒定確證,考察其碎片離子等相關(guān)信息,并在網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫上進行檢索比對。

圖 1 有機溶劑中農(nóng)藥混合標準溶液(2.0 mg/L)的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion chromatograms (TICs) of pesticide mixture standard solution at 2.0 mg/L in organic solvent

1.3.4方法學(xué)驗證

參考SANTE指南[14]對建立的篩查方法完成方法學(xué)驗證,篩查方法的置信度以SDL表示。SDL在指南中定義為已證明在至少95%的樣品中可以檢測到某種分析物(不一定符合明確的鑒定標準)的最低濃度(即接受5%的假陰性率)。

選取21份茶葉空白樣品(其中包括14份綠茶、3份紅茶、2份烏龍茶和2份白茶),分別添加混合標準溶液至4個水平(0.01、0.05、0.10、0.20 mg/kg)后進行前處理和儀器分析。

1.4 實際樣品篩查檢測

選取22份茶葉樣品(其中包括9份綠茶、7份紅茶、4份烏龍茶、1份白茶和1份普洱茶), 應(yīng)用本文建立的方法進行篩查檢測。每批實際樣品檢測前,運行質(zhì)量控制程序,依次分析標準添加樣品、試劑空白、實際樣品、試劑空白、標準添加樣品。根據(jù)標準添加樣品中隨機挑選的10種農(nóng)藥檢測情況判斷篩查系統(tǒng)是否正常運行。

2 結(jié)果與討論

2.1 數(shù)據(jù)庫的建立

由于農(nóng)藥數(shù)據(jù)庫是為同時進行多種類化合物篩查而創(chuàng)建的,因此盡可能多地涵蓋農(nóng)藥品種非常重要。根據(jù)Krauss等[15]的觀點,使用高分辨質(zhì)譜分析化合物有3種思路:1.有參考標準的定向分析;2.無參考標準的可疑半定向分析;3.非定向分析。本文在第一種思路下進行分析,使用農(nóng)藥參考標準物質(zhì)建立質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。

本文共收集112種標準物質(zhì)(均為CRM認證),品種涵蓋殺真菌劑、殺蟲劑、除草劑等農(nóng)藥及農(nóng)藥代謝產(chǎn)物。配制質(zhì)量濃度為2.0 mg/L的農(nóng)藥混合標準溶液,QTOF-MS在預(yù)設(shè)的低碰撞、高碰撞能量下完成數(shù)據(jù)采集,總離子流圖如圖1所示。收集每個化合物的精確質(zhì)量數(shù)、保留時間、碎片離子等信息,并與PubChem、MassBank等網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫進行比對。將每個農(nóng)藥化合物的信息匯總導(dǎo)入到UNIFI軟件中。在112種農(nóng)藥中,有23種農(nóng)藥暫時不能在本實驗條件下進行分析,其余91種農(nóng)藥化合物的分子式、單一同位素質(zhì)量、保留時間和主要診斷離子等數(shù)據(jù)見表1。

由表1可知,91種農(nóng)藥化合物中有72種(占總數(shù)的79.1%)采用質(zhì)子化分子作為診斷離子,18種(占總數(shù)的19.8%)采用碎片離子作為診斷離子,1種化合物(殺線威)(占總數(shù)的1.1%)采用鈉加合物作為診斷離子。在大多數(shù)情況下,質(zhì)子化分子豐度最高;少數(shù)情況,無論在低碰撞能量還是高碰撞能量下,目標物碎片離子豐度比質(zhì)子化分子的豐度高很多,選用碎片離子作為診斷離子;個別情況下,鈉加合物為豐度最高的離子。2017年P(guān)atricia等[16]對食品中630種污染物進行多殘留篩查方法研究,發(fā)現(xiàn)約20%的化合物在誘導(dǎo)碰撞解離(CID)產(chǎn)生的碎片比相應(yīng)的(去)質(zhì)子化分子更豐富,少數(shù)化合物(4%)中鈉或銨加合物被確定為最豐富的離子。

表 1 農(nóng)藥化合物的準確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫(包括元素組成、單一同位素質(zhì)量、保留時間和主要診斷離子及其質(zhì)荷比實驗值)

表 1 (續(xù))

2.2 自動篩查參數(shù)的設(shè)置、優(yōu)化

在使用數(shù)據(jù)處理軟件進行自動篩查分析時,參數(shù)的優(yōu)化設(shè)置對于報告結(jié)果中假陽性和假陰性之間的適度平衡是至關(guān)重要的。假陽性的存在意味著軟件報告了檢出,但隨后無法通過人工驗證程序,其出現(xiàn)會觸發(fā)后續(xù)的鑒定確證流程,造成檢測資源的浪費,影響篩查方法的有效性。假陰性是指化合物在樣品中存在，但未通過篩查與確證程序檢出目標殘留的情況,其出現(xiàn)造成檢測結(jié)果的漏判,影響真實性。在定性篩查工作中,應(yīng)盡可能降低假陽性誤報的數(shù)量,并保證假陰性的數(shù)量可接受(<5%)[17]。與此同時,如何在流程中盡量減少人工干預(yù),也對參數(shù)的設(shè)置提出了更高的要求。

基于DIA的采集模式獲取完整且不受限制的大量數(shù)據(jù)集,其中包括高度卷積的MS/MS譜,這需要用合適的軟件來提取有用的信息。本文使用UNIFI軟件完成這一復(fù)雜任務(wù),其數(shù)據(jù)處理分兩步進行:首先進行峰值檢測,然后應(yīng)用目標篩查參數(shù)匹配識別[18]。本文設(shè)置的篩查參數(shù)主要有保留時間最大偏差、目標物(和碎片)精確質(zhì)量偏差閾值、化合物加合峰形式(M+H、M+Na、M+K、M+NH4),具體參數(shù)設(shè)置參照1.2.2節(jié)。在實際工作中,對篩查參數(shù)的優(yōu)化是一個工作量很大,并且在一定程度上難以取舍的過程。

保留時間是篩查檢測的重要參數(shù)。保留時間偏差窗口設(shè)置太寬可能會產(chǎn)生假陽性誤報,反之,可能會產(chǎn)生假陰性誤報。在篩查過程中發(fā)現(xiàn),與Gómez-Ramos等[19]、Mol等[17]描述一致,在正常適應(yīng)情況下,色譜系統(tǒng)具有一定的穩(wěn)定性,保留時間的偏差通常不大(小于0.1 min),個別情況下,保留時間會有較大偏差(大于0.1 min)。保留時間產(chǎn)生較大偏差很可能受到基質(zhì)的影響[19],另一方面,色譜環(huán)境也能影響目標物的保留時間,這對儀器設(shè)備的使用及維護保養(yǎng)提出了更高的要求。

精確質(zhì)量偏差閾值是篩查檢測的關(guān)鍵參數(shù),為明確的鑒定提供高度的特異性和選擇性。與較低分辨率的質(zhì)譜儀器相比,HRMS精確的質(zhì)量測量可以更加準確地鑒定復(fù)雜基質(zhì)中的目標分析物。多數(shù)研究認為,鑒定所要求的質(zhì)量偏差閾值應(yīng)不超過5×10-6,甚至應(yīng)更低。2010年Bienvenida等[20]使用LC-TOF-MS測定水果軟飲料中的35種多種農(nóng)藥,其中超過90%的農(nóng)藥質(zhì)量偏差低于2×10-6。在本文研究范圍內(nèi),觀察到有約50%的農(nóng)藥質(zhì)量偏差低于2×10-6。因此基于本文實驗條件,選擇5×10-6作為精確質(zhì)量偏差閾值更為合適。隨著現(xiàn)代儀器設(shè)備精度的快速發(fā)展,相信可以用更窄的質(zhì)量偏差閾值分析更多的化合物。除了質(zhì)量偏差和保留時間外,其他參數(shù)(例如加合物、同位素模式)的使用也有助于提高選擇性、降低錯誤檢測率。

2.3 鑒定與確證

分析物的鑒定與確證是對假陽性的評估。SANTE指南[14]中描述“鑒定與確證”需要滿足以下條件:1)至少兩個精確質(zhì)量離子(其中至少有一個碎片離子)質(zhì)量偏差不超過5×10-6; 2)母離子和碎片離子的提取色譜圖保留時間完全重合(基質(zhì)匹配條件下); 3)試樣與標準溶液中離子相對豐度的偏差最好不超過30%。在UNIFI軟件篩查參數(shù)的設(shè)置中已經(jīng)涵蓋了鑒定條件的前兩條,并且還增加了加合物離子、同位素模式等參數(shù)。

在軟件給出的篩查結(jié)果中,我們還需手動對可疑檢出化合物進行鑒定與確證。首先,考察可疑檢出化合物的色譜峰形。其次,計算樣品與參考標準的離子相對豐度。另外,除了與參考標準比對外,還可以與PubChem、MassBank等數(shù)據(jù)庫進行檢索比對。

2.4 方法學(xué)驗證

對于篩查檢測的定性驗證工作非常繁重,也經(jīng)常被忽視,其驗證過程側(cè)重于可檢測性[14],主要目的是在給定的水平下識別陰性和陽性樣品,確認篩查方法的邊界。本文以SDL作為主要驗證參數(shù)。目前很多國家和國際組織對于茶葉的農(nóng)殘都設(shè)定了MRLs,比如日本規(guī)定與茶葉有關(guān)的農(nóng)藥種類有276種,MRLs為0.10～50.0 mg/kg;歐盟規(guī)定的有453種,MRLs為0.01～30.0 mg/kg;我國限量標準GB 2763-2019《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定了483種農(nóng)藥在356種(類)食品中的農(nóng)殘限量。其中有65種涉及茶葉中農(nóng)藥MRLs的規(guī)定,MRLs為0.01～50 mg/kg。本文設(shè)置方法學(xué)驗證的最低濃度水平為0.01 mg/kg。

茶葉是基質(zhì)復(fù)雜的樣品,頻繁篩查分析時須進行充分的驗證[14]。本文從流通市場選取21份茶葉樣品作為空白基質(zhì)樣品進行方法學(xué)驗證。在21份茶葉樣品中分別添加混合標準溶液至4個水平(0.01、0.05、0.10、0.20 mg/kg),然后參照1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)進行篩查檢測,通過對篩查結(jié)果的分析確定91種農(nóng)藥的SDL,實驗結(jié)果見表2。實驗中要保證≤5%的假陰性率,同一濃度水平需要≥20個樣品檢出陽性方可確定為SDL值。

由表2可知,通過對1 911種農(nóng)藥/樣品組合的評估,發(fā)現(xiàn)有66種農(nóng)藥的SDL為0.01 mg/kg, 8種農(nóng)藥的SDL為0.05 mg/kg, 1種農(nóng)藥的SDL為0.10 mg/kg, 3種農(nóng)藥的SDL為0.20 mg/kg,共有13種農(nóng)藥的SDL大于0.20 mg/kg。

在本文的考察范圍內(nèi),SDL高于0.01 mg/kg的25個農(nóng)藥品種中,噠螨靈的SDL為0.05 mg/kg, GB 2763規(guī)定的MRLs為5 mg/kg,本方法SDL低于GB 2763的MRLs;氟蟲脲、吡蚜酮的SDL都大于0.20 mg/kg, GB 2763規(guī)定的MRLs分別為20、2 mg/kg,這兩個農(nóng)藥品種的SDL還需進一步確定。

部分農(nóng)藥品種的SDL大于0.20 mg/kg,原因可能是由于目標化合物在前處理時損失較大,如滅蠅胺、苯醚氰菊酯、氟蟲脲等。其次,部分目標物在本實驗條件下不能很好地電離,在質(zhì)譜上的響應(yīng)信號較弱,如茵草敵、苯噻硫氰、乙氧氟草醚、丁草敵等。在本文的考察范圍內(nèi)觀察到,在質(zhì)譜上的響應(yīng)比較弱的化合物(不僅限于以上提到的幾種化合物),多數(shù)具有在水中溶解度低的化學(xué)特性。比如,根據(jù)PubChem數(shù)據(jù),苯噻硫氰的水中溶解度為5.24×10-4mol/L,乙氧氟草醚的水中溶解度為2.98×10-7mol/L,丁草敵的水中溶解度為2.07×10-4mol/L。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)普遍存在于質(zhì)譜分析中,質(zhì)譜分析中的基質(zhì)效應(yīng)由目標分析物的共提取組分互相作用,影響分析物電離所致,表現(xiàn)為離子增強或抑制作用[21]。針對定性篩查方法,SANTE指南[14]并沒有給出基質(zhì)效應(yīng)的評價方法。通常,定量檢測的基質(zhì)效應(yīng)評價方法主要有柱后注射法與提取后添加法[22],本文參考2003年Matuszewski等[23]提出的提取后添加法對定性篩查方法的基質(zhì)效應(yīng)進行初步評價。選取質(zhì)譜信號較低的3個茶葉樣品作為空白基質(zhì),按照1.3.2節(jié)進行前處理凈化,獲得空白基質(zhì)提取液。分別使用初始流動相和空白基質(zhì)提取液配制4個質(zhì)量濃度(0.1、0.5、1.0、2.0 mg/L)的混合標準工作溶液,每個濃度樣品分別平行制備2份,按照1.3.3節(jié)進行篩查分析。

結(jié)果顯示,在91種農(nóng)藥化合物中僅發(fā)現(xiàn)乙氧氟草醚農(nóng)藥有較明顯的基質(zhì)效應(yīng)。其在流動相溶劑中的質(zhì)量濃度為0.5 mg/L時即可被篩查系統(tǒng)確認檢出,在空白基質(zhì)中需添加標準至2 mg/L才能被篩查系統(tǒng)確認,存在基質(zhì)抑制效應(yīng)。本文考察基質(zhì)效應(yīng)的樣品數(shù)量較少,之后還需要在更多樣品基質(zhì)中進行驗證。2014年,Rajski等[24]的研究認為綠茶樣品提取物會產(chǎn)生信號抑制問題,可能會對靈敏度產(chǎn)生負面影響。一般來說,減輕基質(zhì)效應(yīng)的影響,通常采用稀釋樣品提取液或減少進樣體積等方法[25]。使用離子淌度質(zhì)譜分析也可以有效降低基質(zhì)效應(yīng)的影響,碰撞截面(CCS)值可用于復(fù)雜基質(zhì)的篩查檢測,并且更好地降低了假陽性的出現(xiàn)率[16,26]。

表 2 91種農(nóng)藥在21份不同茶葉樣品中進行定性篩查檢測的方法學(xué)驗證結(jié)果

2．6 實際樣品的分析

參考2015年Wang等[9]的方法,在每批實際樣品分析前,進行系列質(zhì)量控制以檢查篩查系統(tǒng)是否正常運行。以0.01 mg/kg水平的基質(zhì)標準添加樣品作為標準添加樣品、提取過程空白樣品作為試劑空白,按照1.4節(jié)描述的順序,分別在實際樣品序列前后進樣檢測。選取非草隆、地胺磷、氟酰胺、吡草醚等10種農(nóng)藥化合物作為驗證參考靶標,同批進入篩查系統(tǒng)分析。確保在前處理過程中沒有引入實驗室污染,篩查系統(tǒng)正常運行。

圖 2 綠茶樣品中吡唑醚菌酯的UPLC-QTOF-MS色譜圖Fig. 2 UPLC-QTOF-MS chromatograms of pyraclostrobin in green tea samples a. [M+Na]+; b. [M+H]+; c. fragment ion m/z 356.07895; d. fragment ion m/z 296.05830; e. fragment ion m/z 194.08195. Acquisition mode: MSE mode; collision energy: LE (low energy) 4 eV; mass extraction window: ±5×10-6.

表 3 綠茶陽性樣品中吡唑醚菌酯的鑒定數(shù)據(jù)

圖2與表3為某品牌碧螺春樣品中吡唑醚菌酯的鑒定與確證結(jié)果。吡唑醚菌酯的分子式為C19H18ClN3O4,在電噴霧正離子模式下可獲得穩(wěn)定的[M+H]+和[M+Na]+加合離子峰,在低碰撞能量下即可裂解成若干碎片離子。由圖2觀察到,吡唑醚菌酯可裂解成3個片段(m/z356.078 95,296.058 30和194.081 95)。[M+H]+離子可脫去CH4O形成m/z356.075 25 [M+H-CH4O]+,或脫去C3H8O3形成m/z296.058 30 [M+H-C3H8O3]+,并進一步裂解形成m/z194.081 95的碎片離子。本文觀察的吡唑醚菌酯裂解情況與MassBank數(shù)據(jù)庫中LC-ESI-QTOF譜圖中描述一致。由圖2可知,[M+H]+離子在色譜圖上的保留時間為10.36,與加鈉離子和3個碎片離子的提取色譜圖完全重疊。診斷離子及碎片離子的精確質(zhì)量和離子相對豐度的偏差見表3, 3個碎片離子精確質(zhì)量的偏差均不超過5×10-6。

3 結(jié)論

本研究介紹了使用UPLC-QTOF-MS對茶葉中91種農(nóng)藥殘留進行定向篩查方法的開發(fā)和驗證,并將其應(yīng)用于流通市場上茶葉樣品的農(nóng)殘篩查檢測。收集農(nóng)藥參考標準物質(zhì),在MSE模式下進行全信息采集,建立QTOF精確質(zhì)量質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。使用軟件完成自動篩查工作,結(jié)合準確質(zhì)量數(shù)、保留時間、碎片離子信息、同位素模式與加合物等信息進行識別,降低錯誤識別出現(xiàn)的風(fēng)險。參照SANTE指南[14]完成定性篩查方法學(xué)驗證。檢查21種不同茶葉中91種農(nóng)藥的篩查可靠性,評估了1 911種農(nóng)藥/商品組合,確定了78種農(nóng)藥的SDL,剩余13種農(nóng)藥SDL大于0.20 mg/kg。在實際樣品測定中發(fā)現(xiàn)流通市場上的部分樣品檢出農(nóng)藥殘留,并進行了鑒定確證。之后的工作中使用三重四極桿質(zhì)譜儀將篩查出的污染物納入定量分析的監(jiān)測程序中。這個例子清楚地表明,如果沒有全面篩查方法,可能會導(dǎo)致低估食品中存在的農(nóng)藥及代謝物殘留總量的風(fēng)險。

本文在質(zhì)譜的正離子模式下考察部分農(nóng)藥化合物,之后還將在負離子模式下建立分析方法。如今,分析儀器技術(shù)的飛速發(fā)展,對分析的準確度與靈敏度都提出了更高要求。HRMS提供高分辨率、高全掃描靈敏度和選擇性,使其對食品中的污染物的殘留分析極具吸引力。更多的實驗工作使HRMS的研究范圍擴展到其他類型的污染物,或是進行非目標殘留物篩查,但隨之也必須匹配適當(dāng)和切實可行的質(zhì)量控制程序。規(guī)?；暮Y查、鑒定與量化終將在單次常規(guī)分析中融合。