和文倩, 范青飛, 周 蘭, 黃鳳梅, 蔣 仙, 納 智, 胡華斌*, 宋啟示*

(1. 中國科學院西雙版納熱帶植物園, 熱帶植物資源可持續(xù)利用重點實驗室, 云南 昆明 650223; 2. 中國科學院大學, 北京 100049; 3. 普洱學院, 云南 普洱 665000)

氧化巴西木素是蘇木主要成分之一。它是由巴西蘇木素在日光照射下和空氣中的氧氣發(fā)生氧化反應生成的[1]?，F(xiàn)代藥理研究顯示,氧化巴西木素具有抗腫瘤[2,3]、抗炎[4]、抗菌[5]、抗氧化[6]和調(diào)節(jié)免疫[7]等多種藥理活性。此外,氧化巴西木素作為蘇木天然色素成分之一,被廣泛應用于食品、日化、皮革及織物染色等行業(yè)[8],在病理實驗中還被用作細胞組織切片的染色劑[9]。氧化巴西木素應用前景相當廣闊,加大力度開發(fā)其制備工藝,將會對現(xiàn)代醫(yī)療及染色工業(yè)的發(fā)展起著極大幫助。

目前,主要采用傳統(tǒng)柱色譜方法對氧化巴西木素進行分離純化,氧化巴西木素主要集中在乙酸乙酯部位,借助大孔樹脂色譜、硅膠柱色譜、葡聚糖凝膠色譜、高效液相色譜對蘇木的乙酸乙酯部位進行分離純化[10-12]。本研究組在應用傳統(tǒng)柱色譜方法從蘇木中分離巴西蘇木素及氧化巴西木素時,發(fā)現(xiàn)色譜柱中的固體填充材料不僅被染成紅色,而且紅色難以被洗脫,從而造成色譜柱材料的污染以及樣品成分的損失。高效逆流色譜(HPCCC)是一種新型的液液分配萃取技術(shù),無須固體支撐材料,可避免樣品被吸附或損失。高效逆流色譜分離速度快,工作效率高,能夠克服傳統(tǒng)分離方法中存在的缺點,非常適合用于分離具有特殊性質(zhì)的天然產(chǎn)物活性成分[13-16]。

本研究利用HPCCC對蘇木中的活性成分進行分離純化。通過優(yōu)化溶劑系統(tǒng)對氧化巴西木素進行快速分離純化,同時獲取一微量成分,并對其進行純度分析和結(jié)構(gòu)鑒定。該方法不僅快速,簡便,還可避免蘇木中的活性成分氧化巴西木素對色譜柱中的固體填充材料染色、難以洗脫等問題。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑和材料

分析兼半制備型高效逆流色譜儀(Spectrum HPCCC,英國Dynamic Extractions公司),分析高效液相色譜儀(e2695,美國Waters公司),恒流輸液泵、檢測器(德國Knauer公司),循環(huán)水冷卻器(SH150-1000,美國Lab Tech公司),電子天平(中國上海梅特勒-托利多儀器有限公司),超聲清洗器(中國上海Sapeen科學儀器有限公司),核磁共振儀(Bruker AM-400/500 MHz,瑞士Bruker公司)。

HPCCC溶劑系統(tǒng)所用試劑氯仿、甲醇、石油醚、乙酸乙酯為工業(yè)重蒸,水是實驗室自制純凈水,HPCCC分析用色譜甲醇(德國Merck公司),二甲基亞砜-d6(DMSO-d6, 中國百靈威科技公司,包含0.03% (v/v)四甲基硅烷(TMS))。

實驗植物材料蘇木由云南西雙版納州傣醫(yī)院提供,經(jīng)鑒定為蘇木心材。

1.2 實驗方法

1.2.1樣品前處理

將蘇木干燥樣品(10 kg)粉碎,然后按照料液比1∶5 (kg/L)加入50 L 95%乙醇熱回流提取3次,合并提取液,減壓濃縮并旋干,得到乙醇提取物600 g。按照料液比1∶2加蒸餾水溶解,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇溶劑對其進行多次萃取,得石油醚萃取物4.84 g、乙酸乙酯萃取物494.2 g、正丁醇萃取物48.6 g,稱取乙酸乙酯萃取物500 mg進行逆流分離制備。

1.2.2HPCCC分離過程

以氯仿-甲醇-水(4∶3∶2, v/v/v)為溶劑體系,充分混合后,靜置分層,上相溶劑為固定相,下相溶劑為流動相。以流速15 mL/min將固定相泵滿整個螺旋管柱(300 mL),啟動主機,調(diào)整主機轉(zhuǎn)速為1 600 r/min,在15 min左右達到基本穩(wěn)定,此時以流速10 mL/min泵入流動相。待流動相從主機出口流出時,注入已過濾好的樣品,并用自動餾分收集器收集樣品。主機溫度控制在25 ℃,檢測波長設(shè)置為285 nm,分析掃描時間設(shè)置為120 min。

1.2.3HPLC分析條件

將蘇木乙酸乙酯提取物和通過高效逆流分離出的組分進行HPLC的純度分析,樣品用甲醇溶解后用過濾頭裝入2 mL帶蓋液相試劑瓶中。采用分析型Symmety?C_18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm,美國Waters公司),梯度梯度洗脫模式,二極管陣列檢測器(PDA)全波長檢測,以甲醇(A)和水(B)作為流動相。流動相洗脫程序為0～30 min, 5%A～95%A; 30～35 min, 95%A; 35～40 min, 95%A～5%A。流速0.8 mL/min,波長285 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 待測樣品分析

蘇木的活性部位主要集中在乙酸乙酯部分[17,18]。根據(jù)以往的經(jīng)驗,需對蘇木乙酸乙酯萃取物進行HPLC分析,根據(jù)其保留時間來推算極性大小。蘇木乙酸乙酯萃取物HPLC分析結(jié)果見圖1,其大部分化合物出峰時間較早(12～20 min)。根據(jù)實驗設(shè)計,將圖1中一個峰設(shè)定為目標峰并標記,通過洗脫時間可以推斷該目標峰的化合物在乙酸乙酯部位極性相對較大。

圖 1 蘇木乙酸乙酯萃取物的HPLC色譜圖Fig. 1 HPLC chromatogram of the ethyl acetate extract of Caesalpinia sappan

2.2 溶劑體系的篩選

在逆流色譜中,溶劑系統(tǒng)的選擇至關(guān)重要。很多研究者成功應用逆流色譜技術(shù)對不同類型化合物實現(xiàn)了分離[19,20]。大部分研究者在進行溶劑系統(tǒng)篩選時會考察目標化合物的分配系數(shù),接著研究所用逆流色譜的參數(shù),如轉(zhuǎn)速、固定相保留率等對分離效果的影響[21-23]。本文在無須計算目標化合物的分配系數(shù)的前提下,結(jié)合本研究組的工作經(jīng)驗及化合物特點,利用基于薄層色譜的常用溶劑體系估算法(TLC-GUESS法)和搖瓶法(Shake-Flash法)結(jié)合高效逆流色譜分析模式進行溶劑體系的快速篩選。具體的篩選過程如下:

TLC-GUESS方法由Friesen教授和Pauli教授建立,成功應用于逆流色譜溶劑系統(tǒng)的選擇[24]。首先選擇常規(guī)溶劑系統(tǒng)即石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水系統(tǒng),通過TLC-GUESS法分析該溶劑系統(tǒng)的可行性,調(diào)整溶劑比例后,選定適合的溶劑比例,并通過分析逆流色譜進行驗證。結(jié)合課題組之前的工作[25],我們通過TLC-GUESS方法選擇溶劑比例為石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(3∶7∶3∶7, v/v/v/v),并應用逆流色譜分析模式對該溶劑體系進行驗證,從圖2a可以看出,在該溶劑條件下,大部分化合物保留時間較短,峰出現(xiàn)重疊現(xiàn)象,不能實現(xiàn)化合物分離。

圖 2 兩種溶劑體系分離蘇木乙酸乙酯萃取物的HPCCC色譜圖Fig. 2 High performance countercurrent chromatography (HPCCC) chromatograms of the ethyl acetate extract of Caesalpinia sappan with two solvent systems a. petroleum ether-ethyl acetate-methanol-water (3∶7∶3∶7, v/v/v/v); b. chloroform-methanol-water (4∶3∶2, v/v/v).

氧化巴西木素為黃酮類化合物,查閱相關(guān)資料[26]，嘗試使用氯仿-甲醇-水溶劑體系。準備常用的氯仿-甲醇-水(4∶3∶2, v/v/v)溶劑體系,將樣品溶解于等體積的上下相溶劑中,劇烈搖晃5 min后靜置,待上下相分層后可觀察樣品上下相的顏色深淺,判斷上下相分布是否均勻,進而判斷該溶劑系統(tǒng)是否適合做備選溶劑系統(tǒng)(Shake-Flash法)。經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn),樣品上下相顏色深淺一致、分布均勻,即可判斷氯仿-甲醇-水(4∶3∶2, v/v/v)溶劑體系適合做備選溶劑系統(tǒng),應用逆流色譜分析模式對該溶劑系統(tǒng)進行驗證(見圖2b)。

在溶劑系統(tǒng)中,目標物的分配系數(shù)(K)一般在0.5～2.0之間,如果大于2.0或小于0.5,目標化合物可能滯后或提前被洗脫。在TLC-GUESS方法實際操作中,如果一個樣品中的化合物既有分布在0.5～2.0之間的,也有分布在該區(qū)間兩側(cè)的,則認為該溶劑系統(tǒng)是比較合適的。通過比較分析逆流色譜圖2a和圖2b,發(fā)現(xiàn)圖2b中的化合物出峰較均勻,適合化合物分離,最終,氯仿-甲醇-水(4∶3∶2)溶劑系統(tǒng)被選做較佳溶劑體系。

2.3 HPCCC的制備

本實驗選擇氯仿-甲醇-水(4∶3∶2, v/v/v)作為HPCCC分離蘇木乙酸乙酯提取物的溶劑系統(tǒng)。樣品上樣量為500 mg,應用反相洗脫模式對樣品進行分離(見圖3)。蘇木中含有化合物種類較多,各個峰之間分離度較小,運用自動收集器對樣品進行收集。通過TLC點板分析,發(fā)現(xiàn)餾分ccc-32和ccc-39僅有一個主點。故采用1.2.3節(jié)的HPLC法對HPCCC收集到的ccc-32和ccc-39進行純度分析并進行鑒定(見圖4)。根據(jù)保留時間,峰面積歸一化法推斷餾分ccc-39為化合物1(15.2 mg,純度為95.6%), ccc-32為化合物2(5.3 mg,純度為89.0%)。組分ccc-32與圖1中的蘇木乙酸乙酯萃取物沒有較明顯重合的峰,推斷組分化合物2為蘇木乙酸乙酯萃取物中一微量成分?？梢娔媪魃V技術(shù)可以應用于微量成分的富集和分析中。

圖 3 蘇木乙酸乙酯萃取物的高效逆流色譜圖Fig. 3 HPCCC chromatogram of the ethyl acetate extract of Caesalpinia sappan

圖 4 HPCCC分離得到的ccc-39和ccc-32的HPLC色譜圖Fig. 4 HPLC chromatograms of ccc-39 and ccc-32 from the ethyl acetate extract of Caesalpinia sappan by HPCCC

2.4 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

將分離的化合物進行1H-NMR和13C-NMR分析,對其進行結(jié)構(gòu)鑒定。具體數(shù)據(jù)如下:

化合物1:分子式C16H12O5,紅色無定型粉末;1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ: 7.79 (1H, d,J=8.9 Hz, H-1), 7.10 (1H, s, H-11), 6.56 (1H, dd,J=8.9, 2.4 Hz, H-2), 6.35 (1H, d,J=2.4 Hz, H-4), 6.31 (1H, s, H-8), 4.44 (1H, d,J=11.6 Hz, H-6), 4.00 (1H, d,J=11.8 Hz, H-6), 2.83 (1H, d,J=18.4Hz, H-7), 2.81 (1H, d,J=18.4 Hz, H-7′);13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ: 179.4 (C-9), 162.3 (C-3), 159.0 (C-7a), 157.7 (C-4a), 152.4 (C-10), 151.6 (C-12), 130.6 (C-1), 126.1 (C-11a), 117.5 (C-8), 110.8 (C-1a, 2), 104.1 (C-11), 102.9 (C-4), 74.2 (C-6a), 72.9 (C-6), 39.7 (C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]基本一致,故鑒定為氧化巴西木素,化學結(jié)構(gòu)如圖5所示。

圖 5 化合物1和2的結(jié)構(gòu)式Fig. 5 Chemical structures of compounds 1 and 2

化合物2:分子式C32H32O12,1H-NMR (800 MHz, DMSO-d6)δ: 6.91 (2H, d,J=8.0 Hz, H-12), 6.91 (2H, d,J=8.0 Hz, H-12′), 6.68 (1H, s, H-6), 6.62 (1H, s, H-3), 6.59 (1H, s, H-6′), 6.54(1H, s, H-3′), 6.47 (1H, dd,J=8.8 Hz, H-11′& 11), 6.46 (1H, d,J=2.2 Hz, H-9′), 6.45(1H, dd,J=2.2 Hz, H-9), 4.25 (1H, d,J=12 Hz, H-15′), 4.13(1H, d,J=12 Hz, H-15), 3.95 (1H, d,J=12 Hz, H-15), 3.93 (3H, m, H-15′, 16, 16′), 3.75 (1H, d,J=12 Hz, H-16′), 3.73 (1H, d,J=12 Hz, H-16), 4.25 (1H, d,J=12.0 Hz, H-16′), 3.74(1H, d,J=12.0 Hz, H-16), 2.68 (2H, s, H-13′), 2.37 (1H, d,J=13.6 Hz, H-13), 2.34(1H, d,J=13.6 Hz, H-13);13C-NMR (200 MHz, DMSO-d6)δ: C 159.2 (C-8), 157.8 (C-8′), 157.7 (C-10′), 157.6 (C-10), 143.6 (C-4, 4′), 143.6 (C-5), 143.6 (C-5′), 131.9 (C-12), 131.0 (C-12′), 131.0 (C-1), 129.5 (C-1′), 126.8 (C-2′), 126.3 (C-2), 123.8 (C-7′), 121.9 (C-7), 119.4 (C-3), 118.4 (C-3′), 116.6 (C-6′), 116.1(C-6), 111.0 (C-11′), 110.1 (C-11), 107.9 (C-9′), 106.9 (C-9), 76.3 (C-15′), 74.7 (C-15), 71.4 (C-14′), 71.2 (C-14), 67.2 (C-16), 64.3 (C-16′), 42.0 (C-13′), 38.9 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與參考文獻[27]基本一致,故鑒定為caesappanin C,化學結(jié)構(gòu)見圖5。

3 結(jié)論

氧化巴西木素不僅是一藥用化學成分,還是天然的染色劑,具有染色功能,用傳統(tǒng)的柱色譜法分離,會將色譜柱中的固體填充材料染成粉紅色且難以洗脫,造成對色譜柱材料的污染以及氧化巴西木素的損失。本文應用HPCCC對蘇木中的活性成分氧化巴西木素進行了快速分離制備。該方法簡便可行,不僅可以解決氧化巴西木素的染色污染的問題,而且還可以為類似染色類成分分離制備提供技術(shù)指導。