趙興云, 張紅燕, 周孝禹, 王 莉, 萬麗紅, 吳仁安*

(1. 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所高分辨質(zhì)譜技術(shù)研究組, 遼寧 大連 116023; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

糖類化合物的色譜分析對于深入研究其結(jié)構(gòu)表征和生物活性具有重要意義[1,2]。糖類化合物是含有多羥基的強(qiáng)極性化合物,在反相色譜上基本不保留,在正相色譜非極性流動相中溶解度低[3,4],且多糖類結(jié)構(gòu)多樣,異構(gòu)體成分多[5],進(jìn)行分離純化以及純度鑒別較困難[2,6],因而必須尋求高效富集和分離檢測的新材料和新方法[7-9]。

納米材料在分析化學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用擴(kuò)大了納米材料的應(yīng)用范圍[10],也促進(jìn)了蛋白質(zhì)組學(xué)[11,12]、糖組學(xué)[11,13]等各研究領(lǐng)域的不斷發(fā)展,其中比表面積大、介孔結(jié)構(gòu)清晰狹窄的介孔碳材料[14]為組學(xué)的研究提供了有力工具。有序介孔碳復(fù)合材料[15]、磁性核殼介孔碳[16]、有序硅碳復(fù)合納米纖維[17]等新型復(fù)合材料也被不斷發(fā)展，并基于其對多肽的疏水、靜電相互作用和對相對分子質(zhì)量較大蛋白質(zhì)的尺寸排阻效應(yīng)，被用于作為固定化酶反應(yīng)器或者用于選擇性富集復(fù)雜樣品中的內(nèi)源性肽[18]以及磷酸化肽[12,19]。同時基于納米孔碳材料和多糖之間具有較強(qiáng)的相互作用及納米孔碳材料對蛋白質(zhì)的尺寸排阻作用,已有多篇報道[20,21]將納米孔碳材料應(yīng)用于糖蛋白酶解中的糖鏈富集中。然而這些材料形貌不規(guī)格,粒徑小,有的存在微孔,限制了其在色譜柱方面的應(yīng)用。

本文將苯酚和甲醛通過物理吸附作用，在二氧化硅表面和孔內(nèi)聚合形成淡黃色酚醛樹脂(PF),最后在氮氣氣氛中煅燒得到黑色核殼硅碳復(fù)合微球(Sil@MC)材料。該方法簡單高效,經(jīng)過氦離子掃描顯微鏡和氮氣物理吸附脫附表征,證明碳材料均勻地固定在二氧化硅表面上,涂覆后仍具有良好的單分散性,且比表面積和孔徑也并未減少。將Sil@MC材料填充于高效液相色譜固定相中,發(fā)現(xiàn)硅碳材料與糖類具有較強(qiáng)的相互作用,Sil@MC色譜柱對糖類及糖類同分異構(gòu)體具有良好的分離性能,峰形良好。該方法拓展了色譜固定相的合成思路,獲得了一種有潛力的色譜固定相。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Orion Nanofab掃描氦離子顯微鏡(Carl Zeiss,德國); Quantachrome SI氮氣物理吸附/脫附儀(QuantaChrome,美國); 1290液相色譜(安捷倫,美國); 15-T Solari X混合傅里葉變換離子回旋共振-質(zhì)譜儀(FT-ICR-MS, Bruker Daltonics,德國)。

二氧化硅(粒徑5 μm,孔徑9.5 nm)由中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所王樹東課題組提供。D-(+)-氨基葡萄糖鹽酸鹽(D-(+)-glucosamine hydrochloride)、葡萄糖(glucose)、D-(+)-海藻糖二水合物(D-(+)-trehalose dihydrate)、棉子糖(raffinose)購自上海阿拉丁試劑公司。松三糖、耐斯糖和水蘇糖購自大連美侖生物科技公司。3′-唾液酸乳糖(3′-sialyllactose, 3′-SL)、6′-唾液酸乳糖(6′-sialyllactose, 6′-SL)、乳-N-新四糖(LNnT, Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glc)、乳-N-四糖(LNT, Galβ1→3GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glc)購自上海甄準(zhǔn)科研試劑公司。乙腈(ACN)購自美國Tedia公司。實驗用水經(jīng)Milli-Q水處理系統(tǒng)(Millipore公司,美國)處理。除特別說明,實驗所用化學(xué)試劑均分析純。

1.2 Sil@MC的制備及裝柱過程

參考文獻(xiàn)[22]合成方法,在100 mL乙醇-水(1∶2, v/v)中加入0.5 g二氧化硅微球,混合均勻后,加入0.093 g苯二酚和171 μL氨水。于60 ℃磁力攪拌2 h后,逐滴加入126 μL甲醛,反應(yīng)后離心或者抽濾洗滌,樣品干燥后,將所得固體于氮氣氣氛中處理6 h,即可獲得核殼硅碳復(fù)合微球Sil@MC材料,最后采用勻漿法填充于色譜柱中。

1.3 色譜分離條件

色譜柱規(guī)格:100 mm×2.1mm,柱溫:30 ℃,流速:0.3 mL/min,流動相A:水(含0.1%(v/v)甲酸),流動相B:乙腈。

檢測器:FT-ICR-MS,正離子模式,采集范圍m/z150～3 000;分辨率:200 000;電壓:4 500 V;干燥氣溫度200 ℃,流速4 L/min。

2 結(jié)果和討論

2.1 Sil@MC固定相的表征

首先,采用掃描顯微鏡觀察二氧化硅與合成的Sil@MC材料的形貌(見圖1a和1b)。根據(jù)圖像,觀察到Sil@MC材料更加明亮,這是因為碳材料的導(dǎo)電性優(yōu)于二氧化硅材料。二氧化硅與合成的Sil@MC材料均勻分散,粒徑均在5 μm左右。

圖 1 (a)二氧化硅和(b)Sil@MC材料的掃描氦離子顯微鏡圖Fig. 1 Scanning helium-ion micrographs of (a) silica and (b) core-shell silica@mesoporous carbon (Sil@MC) material

圖 2 二氧化硅和Sil@MC材料的(a)N2吸附脫附等溫線及(b)BJH吸附孔大小分布圖Fig. 2 (a) N2 adsorption isotherm and (b) BJH adsorption pore size distribution graphs of silica and Sil@MC material

圖 3 極性糖類化合物在(a,b)二氧化硅和(c,d)Sil@MC色譜柱上的分離Fig. 3 Separation of polar sugar compounds on the (a, b) SiO2 and (c, d) Sil@MC columns Mobile phase: (A) water (containing 0.1% (v/v) formic acid) and (B) acetonitrile; gradient elution program: 0-1.5 min, 3%B, 1.5-3.0 min, 3%B-40%B. Peak Nos.: 1. D-(+)-glucosamine hydrochloride; 2. glucose; 3. D-(+)-trehalose dihydrate; 4. raffinose.

圖2a和圖2b為二氧化硅和Sil@MC固定相的氮氣吸脫附等溫線和孔徑分布圖。經(jīng)計算，二者比表面積分別為300 m2/g和302 m2/g。二者平均孔徑均為9.5 nm,然而Sil@MC固定相孔徑分布變窄,孔容(0.63 cm3/g)低于二氧化硅固定相的孔容(0.92 cm3/g),證明實驗成功合成了薄殼層Sil@MC材料。

2.2 Sil@MC固定相在糖類化合物分離中的應(yīng)用

本工作將未涂覆酚醛樹脂的二氧化硅材料和Sil@MC材料填充到色譜柱中,選擇D-(+)-氨基葡萄糖鹽酸鹽、葡萄糖(單糖)、D-(+)-海藻糖二水合物(二糖)和棉子糖(三糖)為分析對象,研究兩種色譜柱對極性糖類化合物的分離性能。如圖3a所示,采用未涂覆酚醛樹脂的二氧化硅色譜柱、流動相中ACN含量從3%增加到40%時,4種化合物只得到一個色譜峰；如圖3c所示，采用Sil@MC色譜柱時，在相同流動相梯度洗脫程序下,4種化合物在4 min內(nèi)實現(xiàn)基線分離,出峰順序分別為D-(+)-氨基葡萄糖鹽酸鹽、葡萄糖、D-(+)-海藻糖二水合物和棉子糖,保留時間分別為0.38、0.53、0.86和2.98 min，說明Sil@MC材料對糖類具有保留作用，且糖單元越多,極性糖類化合物在Sil@MC固定相上的保留作用越強(qiáng)。

接著,實驗應(yīng)用Sil@MC色譜柱測試其對低聚糖異構(gòu)體化合物(松三糖和棉子糖、耐斯糖和水蘇糖)的分離性能。如圖4a所示，當(dāng)流動相中乙腈的體積分?jǐn)?shù)從3%增加到40%時,三糖化合物松三糖和棉子糖依次洗脫,其保留時間分別為3.30 min和3.42 min,其質(zhì)譜圖見圖4b；如圖4c所示，在相同流動相條件下,四糖化合物耐斯糖和水蘇糖均被依次洗脫,其保留時間分別為3.13 min和3.64 min,其質(zhì)譜圖見圖4d。

實驗同樣應(yīng)用Sil@MC色譜柱測試其對人乳樣品中兩種唾液?；溉楣烟钱悩?gòu)體(3′-SL和6′-SL)的分離性能,其色譜分離圖見圖5a。可以看出，3′-SL和6′-SL分別從Sil@MC色譜柱上洗脫,實現(xiàn)了異構(gòu)體的分離。3′-SL和6′-SL的保留時間分別為3.89 min和4.32 min，對應(yīng)質(zhì)譜圖見圖5b。在人乳樣品中，有兩個性質(zhì)非常相近的四糖異構(gòu)體，即LNT和LNnT,它們僅在一個鍵位上有所不同。采用Sil@MC色譜柱、在優(yōu)化的梯度洗脫條件下,LNT和LNnT依次被洗脫(見圖5c),其保留時間分別為4.62 min和4.98 min,對應(yīng)質(zhì)譜見圖5d。

圖 4 低聚糖同分異構(gòu)體在Sil@MC色譜柱上的分離Fig. 4 Separation of oligosaccharides isomers on the Sil@MC column Mobile phase: (A) water (containing 0.1% (v/v) formic acid) and (B) acetonitrile; gradient elution program: 0-1.5 min, 3%B, 1.5-3.5 min, 3%B-40%B, 3.5-10 min, 40%B-80%B. Peak Nos.: 1. melezitose; 2. raffinose; 3. nystose; 4. stachyose.

圖 5 人乳寡糖異構(gòu)體在Sil@MC色譜柱上的分離Fig. 5 Separation of human milk oligosaccharides isomers on the Sil@MC column Mobile phase: (A) water (containing 0.1% (v/v) formic acid) and (B) acetonitrile; gradient elution program: for Fig. 5a, 0-2 min, 3%B, 2-4 min, 3%B-20%B, 4-10 min, 20%B-80%B; for Fig. 5c, 0-1.5 min, 3%B, 1.5-4.0 min, 3%B-30%B, 4-10 min, 30%B-80%B. Peak Nos.: 1. 3′-sialyllactose (3′-SL); 2. 6′-sialyllactose (6′-SL); 3. lacto-N-tetraose (LNT); 4. lacto-N-newtetraose (LNnT).

3 結(jié)論

本文以二氧化硅為內(nèi)核,通過簡單的方法合成了Sil@MC材料,克服了納米孔碳材料不能直接用作HPLC固定相的問題,涂覆后的材料比表面積和孔徑改變較少,在高效液相色譜-質(zhì)譜體系中,D-(+)-氨基葡萄糖鹽酸鹽、葡萄糖、D-(+)-海藻糖二水合物、棉子糖4種極性糖類化合物在合成的Sil@MC色譜柱上實現(xiàn)了分離,而這4種化合物在未涂覆酚醛樹脂的二氧化硅色譜柱上未得到分離。將Sil@MC色譜柱應(yīng)用于低聚糖同分異構(gòu)體的分離,代表性低聚糖和乳寡糖中三糖或四糖異構(gòu)體均實現(xiàn)了分離,體現(xiàn)了優(yōu)異的碳-糖相互作用性能。結(jié)果表明,本文采用了簡單的方法成功將酚醛樹脂基碳材料引入到色譜固定相中，證明核殼型硅碳復(fù)合材料是一種具有前景的高效液相色譜固定相材料。