王 偉 劉星雨 尚云龍 姚建標 王建方 宋永標 王如偉?

（1.浙江中醫(yī)藥大學藥學院， 浙江 杭州310052； 2.浙江康恩貝制藥股份有限公司， 浙江 杭州310052；3.浙江省中藥制藥技術重點實驗室， 浙江 杭州310052； 4.內(nèi)蒙古康恩貝藥業(yè)有限公司圣龍分公司，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯017400）

“血清藥物化學” 這一理論最先由德國科學家格哈德·多馬克所提出［1］，后來我國科學家王喜軍教授［2］提出符合中醫(yī)藥理論的中藥血清藥物化學。中藥成分較為復雜［3］，經(jīng)口服給藥后，普遍認為發(fā)揮藥效的活性成分應該是被吸收入血的成分［4］。通過分析口服給藥后血中成分，可確定中藥在體內(nèi)直接起作用藥效成分。網(wǎng)絡藥理學［4?7］通過生物學網(wǎng)絡中節(jié)點的連接和關系來分析藥物對疾病網(wǎng)絡的干預，從整體效應角度預測藥物靶點，是闡明中藥復方作用機制的重要手段之一。近年來文獻［8?12］報道的網(wǎng)絡藥理學研究大多數(shù)是以各數(shù)據(jù)庫中成分的口服生物利用度為篩選指標。然而多味中藥在組成復方后，其原本的一些成分在其它成分的協(xié)同作用下，會使其原本較低的生物利用度得到改善，并且更改相應的藥物劑型也會提高其生物利用度［13?14］。因此對于多成分的中藥復方制劑，僅靠數(shù)據(jù)庫中的口服生物利用度為篩選指標，會導致靶點預測不夠精確。麝香通心滴丸為內(nèi)蒙古康恩貝藥業(yè)有限公司圣龍分公司已上市產(chǎn)品，收載于2015 年版《中國藥典》 一部，于2017 年1 月13 日被列入國家中藥保護品種，全方包括麝香、蟾酥、人參莖葉總皂苷、丹參、人工牛黃、熊膽粉、冰片，該品種屬于心腦血管領域用藥［15?17］。雖然臨床上治療冠心病療效顯著，但其藥效物質基礎并不明確。本文通過HPLC?Q?TOF／MS 對麝香通心滴丸進行血清藥物化學研究，并基于網(wǎng)絡藥理學對入血成分治療冠心病的作用機制進行研究，為深入闡明麝香通心滴丸作用機制提供一定的依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 1260 高效液相色譜儀、6530 Q?TOF／MS 四極桿飛行時間質譜儀（美國安捷倫公司）；高速冷凍離心機、渦旋振蕩器（美國賽默飛世爾科技公司）；Sartorius BS210S十萬分之一電子天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 試劑與藥物 麝香通心滴丸（內(nèi)蒙古康恩貝有限公司圣龍分公 司，批 號180607）。蟾毒靈（批 號111981?201501，純度99.2%）、熊去氧膽酸（批號110755?201704，純度99.4%）、脂蟾毒配基（批號110718?201809，純度98%）購自中國食品藥品檢定研究院；遠華蟾毒精（批號PS010798，純度98%）、去乙酰華蟾毒精（批號PS010804，純度98%）購自成都普思生物科技股份有限公司；沙蟾毒精（批號5283，純度98%）、甘氨膽酸（批號6723，純度98%）購自上海詩丹德標準技術服務有限公司；?；悄懰幔ㄅ朠ST190801?061，純度98%）購自成都樂美天醫(yī)藥科技有限公司。乙腈（批號SHBK3440，色譜純）、甲醇（批號10958407824，色譜純）購自默克化工技術（上海）有限公司。

1.3 動物 5 只SPF 級健康雄性SD 大鼠，購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2013?0016，由浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心代為飼養(yǎng)，使用許可證號 SYXK（浙）2013?0184，條件為溫度（22±1）℃，相對濕度50%～60%，12 h 光照，通風頻率15～20 次／h。大鼠以標準飼料喂養(yǎng)，飲水自由，倫理審查決議編號ZSLL?2017?054。

2 方法

2.1 麝香通心滴丸入血成分分析

2.1.1 麝香通心滴丸混懸液制備 取適量麝香通心滴丸粉研磨成粉末，加入適量0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，調(diào)整質量濃度為0.4 g／mL，即得，搖勻備用。

2.1.2 動物給藥與血清樣品采集 SD 大鼠給藥前禁食12 h，自由飲水，以6.4 g／kg 劑量給藥。給藥前采集空白血樣，在給藥15、30、45、60 min 后眼眶取血各約0.5 mL，收集至EP 管中靜 置30 min，室溫下以3 000 r／min 離心10 min，取上層血清，備用。

2.1.3 血清樣本處理 分別精密吸取200 μL 空白血清和含藥血清（將“2.1.2” 項下4 個時間點含藥血清各吸取50 μL 混勻）于1.5 mL EP 管內(nèi)，加入5 倍量甲醇渦旋5 min，離心（4 ℃、10 000 r／min）10 min，上清液于常溫下氮氣吹干，100 μL 甲醇復溶，渦旋5 min，離心（4 ℃、10 000 r／min）5 min，取上清液供MS 分析。

2.1.4 色譜條件 Hydro?RP C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，4 μm）；流動相0.4% 甲酸乙腈（A）?0.2% 甲酸水（B），梯度洗脫（0～5 min，5% A；5～13 min，5～20% A；13～40 min，20～22% A；40～60 min，22～45% A；60～75 min，45～75 A%）；柱溫30 ℃；體積流量1.3 mL／min；進樣量10 μL。

2.1.5 質譜條件 離子源ESI，掃描方式ESI＋、ESI?模式；干燥氣體溫度320 ℃，體積流量10 L／min；鞘氣溫度350 ℃，體積流量12 L／min；碎裂能量175 V；毛細管電壓3 kV；正負離子采集范圍m／z50～1 500。

2.2 網(wǎng)絡藥理學研究

2.2.1 預測潛在靶點 將分析得到的麝香通心滴丸入血成分通過PubChem 數(shù)據(jù)庫得到其mol2 格式文件，并將其上傳至PharmMapper 服務器（限定靶蛋白為人類，其余為默認選項），采用“藥效團匹配方法” 得到虛擬篩選結果。將篩選出的分子?靶點匹配度（Fit Score）大于等于3 的藥物靶點作為靶蛋白，并通過UniProt 數(shù)據(jù)庫輸入篩選得到的蛋白靶點PDBID，經(jīng)檢索和轉化操作得到的麝香通心滴丸入血成分的潛 在作用靶點。通 過 GeneCards 數(shù)據(jù)庫，以“coronary atherosclerotic heart disease” 為關鍵詞，檢索與冠心病相關的基因，并與上述成分靶點匹配進行分析，篩選與麝香通心滴丸入血成分相關的作用靶點。

2.2.2 蛋白相互作用網(wǎng)絡構建與分析 String 數(shù)據(jù)庫是一種包含已知和預測蛋白質與蛋白質相互作用的數(shù)據(jù)庫，將上述成分?疾病交集靶點導入String 數(shù)據(jù)庫，限定物種為人類（Homo sapiens），最低相互作用閥值設為高等置信度0.9 “highest confidence”，同時顯示設置隱藏游離點，然后下載PPI 圖形件并保存tsv 文件，最后使用R 語言對得到的PPI 進行核心基因的篩選，其余參數(shù)保持默認設置。

2.2.3 靶標GO 富集分析和KEGG 通路富集分析 本研究通過David 6.7 數(shù)據(jù)庫，對成分?疾病交集靶點蛋白進行GO富集分析、KEGG 通路富集分析，其中GO 富集分析包括生物過程（biological process）、分子功能（molecularfunction）和細胞組分（cellular component）3 個部分，Select Identifier設置為Official GeneSymbol，List Type 設置為Gene List，限定物種為人，并用FDR 錯誤控制法對P 值作檢驗校正，最終以“P＜0.05” 作為條件進行篩選，篩選出具有顯著差異的代謝通路。

2.2.4 入血成分與核心靶點的分子對接 對上述麝香通心滴丸的入血成分與核心靶基因進行分子對接，首先通過PubChem 數(shù)據(jù)庫得到各分子的化學結構式。在PDB 數(shù)據(jù)庫檢索靶基因蛋白構象，并根據(jù)以下條件篩選：通過X 晶體衍射法獲取的蛋白結構；蛋白的晶體解析度小于3 ?；分型明確的蛋白。然后，使用AutoTools 對蛋白進行加氫去除水分子預處理，AutoGrid 進行能量格點計算，Autodock Vina 進行小分子與蛋白對接，對每個對接進行結合能（af?finity）評分，PyMoL 作活性分子和蛋白的互相作用圖。

3 結果

3.1 麝香通心滴丸大鼠入血成分分析 健康大鼠灌胃給予麝香通心滴丸混懸液后，血清樣品的正負離子圖（BPC 模式）見圖1，與對照品離子圖比對后共鑒定出8 種入血成分，見表1。

表1 麝香通心滴丸入血成分

化合物1：正離子模式下，一級質譜分析其準分子離子為m／z417.227 1 ［M＋H］＋，保留時間為41.239 min，對其進行二級質譜分析，結果見圖2，其主要的碎片離子有m／z399.215 2 ［M?H2O＋H］＋、363.191 7 ［M?3H2O＋H］＋。將沙蟾毒精的標準品溶液進行HPLC?MS／MS 分析，所得的一級與二級質譜及保留時間與化合物1 相同，由此確認其為沙蟾毒精。

圖1 樣品血清離子圖

化合物2：負離子模式下，一級質譜分析其準分子離子為m／z514.283 3 ［M?H］-，保留時間為52.446 min，對其進行二級質譜分析，結果見圖3，其主要的碎片離子m／z496.271 6 為準分子離子失去1 分子H2O ［M?H2O?H］-。將?；悄懰岬臉藴势啡芤哼M行HPLC?MS／MS 分析，所得的一級與二級質譜及保留時間與化合物2 相同，由此確認其為?；悄懰?。

圖2 沙蟾毒精質譜圖

圖3 牛磺膽酸質譜圖

化合物3：正離子模式下，一級質譜分析其準分子離子為m／z403.247 1 ［M＋H］＋，保留時間為55.824 min，對其進行二級質譜分析，結果見圖4，其主要的碎片離子有m／z367.226 4 ［M?2H2O＋H］＋、349.216 3 ［M?3H2O＋H］＋、253.193 9 ［M?C5H9O5＋H］＋、215.179 0 ［M?C8H11O5＋H］＋。將遠華蟾毒精的標準品溶液進行HPLC?MS／MS 分析，所得的一級與二級質譜及保留時間與化合物3 相同，由此確認其為遠華蟾毒精。

圖4 遠華蟾毒精質譜圖

化合物4：負離子模式下，一級質譜分析其準分子離子為m／z464.302 5 ［M?H］，保留時間為56.952 min，對其進行二級質譜分析，結果見圖5，其主要的碎片離子m／z402.299 6 為準分子離子失去1 分子水和1 分子羧基［M?H2O?COOH?H］-。將甘氨膽酸的標準品溶液進行HPLC?MS／MS 分析，所得的一級與二級質譜及保留時間與化合物4 相同，由此確認其為甘氨膽酸。

圖5 甘氨膽酸質譜圖

化合物5：正離子模式下，一級質譜分析其準分子離子為m／z401.231 3 ［M＋H］＋，保留時間為60.756 min，對其進行二級質譜分析，結果見圖6，其主要的碎片離子為準分子離子m／z365.200 9 失去2 分子H2O ［M?H2O＋H］＋。將去乙酰華蟾毒精的標準品溶液進行HPLC?MS／MS 分析，所得的一級與二級質譜及保留時間與化合物5 相同，由此確認其為去乙酰華蟾毒精。

圖6 去乙酰華蟾毒精質譜圖

化合物6：正離子模式下，一級質譜分析其準分子離子為m／z387.251 6 ［M＋H］＋，保留時間為62.649 min，對其進行二級質譜分析，結果見圖7，其主要的碎片離子有m／z369.242 1 ［M?H2O ＋H］＋、351.231 3 ［M?2H2O ＋H］＋、255.209 6 ［M?C5H7O4］＋。將蟾毒靈的標準品溶液進行HPLC?MS／MS 分析，所得的一級與二級質譜及保留時間與化合物6 相同，由此確認其為蟾毒靈。

圖7 蟾毒靈質譜圖

化合物7：負離子模式下，一級質譜分析其準分子離子為m／z437.290 6 ［M＋COOH］-，保留時間為65.025 min，對其進行二級質譜分析，結果見圖8，其主要的碎片離子m／z391.284 3 為準分子離子失去1 分子甲酸［M?HCOOH］-。將熊去氧膽酸的標準品溶液進行HPLC?MS／MS 分析，所得的一級與二級質譜及保留時間與化合物7 相同，由此確認其為熊去氧膽酸。

圖8 熊去氧膽酸質譜圖

化合物8：在正離子模式下，一級質譜分析其準分子離子為m／z385.237 2 ［M＋H］＋，保留時間為68.868 min，對其進行二級質譜分析，結果見圖9，其主要的碎片離子有m／z367.227 2 ［M?H2O＋H］＋、349.214 9 ［M?2H2O＋H］＋、253.194 8 ［M?C5H7O4］＋。將脂蟾毒配基的標準品溶液進行HPLC?MS／MS 分析，所得的一級與二級質譜及保留時間與化合物8 相同，由此確認其為脂蟾毒配基。

3.2 麝香通心滴丸入血成分網(wǎng)絡藥理學研究

3.2.1 作用靶點預測 將麝香通心滴丸8 個入血成分上傳至PharmMapper 數(shù)據(jù)庫后得到的所有靶點，刪除重復并整合得到作用靶點249 個。通過與GeneCards 數(shù)據(jù)庫中的1 778個與冠心病相關基因進行匹配，并通過R 軟件繪制韋恩圖，篩選出134 個成分?疾病交集靶點，見表2、圖10。再通過Cytoscape 3.7.1 軟件將8 個入血成分與134 個成分?疾病交集靶點相連，繪制出麝香通心滴丸的藥物?靶點相互作用的網(wǎng)絡圖，見圖11。

3.2.2 蛋白相互作用網(wǎng)絡構建與分析 將韋恩圖得到的134 個交集基因輸入String 數(shù)據(jù)庫中進行分析得到PPI 圖，見圖12，其中包括134 個節(jié)點，347 條邊，平均節(jié)點度值為5.18，PPI 富集P 值少于1.0×1016，其中節(jié)點表示蛋白，每條邊則表示蛋白與蛋白之間的相互作用關系，線條越多表示關聯(lián)度越大。將String 中下載的tsv 文件用R 語言進行處理（以各蛋白連接的節(jié)點個數(shù)為指標，列舉節(jié)點數(shù)排名前30 個的蛋白），得到PPI 中的核心基因絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、酪氨酸激酶（SRC）、磷脂酰肌醇3 激酶（PIK3R1）等核心基因，見圖13。

圖9 脂蟾毒配基質譜圖

表2 成分?疾病交集靶點

圖10 藥物?疾病交集靶標韋恩圖

3.2.3 靶標GO 富集分析及通路富集分析結果 利用David 6.7 平臺對134 個藥物?疾病交集靶點進行GO 富集分析及通路富集分析。GO 富集分析包括分子功能分析、細胞組分分析、生物學過程分析，以?lgP值進行排名并列出排名前15 的途徑，見圖14。在分子功能層面主要涉及類固醇激素受體活性、配體依賴性核受體活性等方面；在細胞組分層面主要涉及細胞外基質、細胞質、細胞質囊泡等方面；生物學過程層面主要涉及有機物質的反應、內(nèi)源性刺激的反應、激素刺激的反應、調(diào)節(jié)細胞增殖等方面。對富集得到的通路結果，以?lgP值及各通路連接的基因數(shù)從大到小進行排名，見圖15。通過查閱文獻，該8 個入血成分可能通過ErbB signaling pathway、VEGF signaling pathway、PPAR signaling pathway 等信號通路治療冠心病。

圖11 藥物?靶點相互作用網(wǎng)絡圖

圖12 麝香通心滴丸入血成分與疾病共有靶點PPI 網(wǎng)絡圖

3.2.4 分子對接 講上述8 個入血成分與上述互作關系排名前10 的核心靶點進行分子對接，結果見表3，結合能（affinity）越小則對接結果越好，affinity＜-7 表示具有較好的結合活性，可見該8 個入血成分與大多數(shù)核心靶點對接結果基本較好。其中，去乙酰華蟾毒精與MAPK1 結合活性最高，其分子對接細節(jié)模擬見圖16，可知小分子結合在蛋白的活性口袋，并且有和活性口袋有較好的匹配。

4 討論

本文前期按照一定梯度濃度探索麝香通心滴丸最佳給藥劑量［18］，分別以0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 g／kg 的給藥劑量對SD 大鼠進行灌胃，并對各劑量組下的大鼠分別于給藥15、30、45、60、75、90、105、120 min 后進行眼眶取血并分析血樣。結果，大鼠在6.4、12.8 g／kg 劑量下各時間段含藥血清的離子流圖更豐富，并且基本一致，但12.8 g／kg 較為濃稠，給灌胃帶來不便。最終，以6.4 g／kg為大鼠給藥劑量。

圖13 節(jié)點數(shù)目前30 的靶點

本研究參考文獻［19?20］，分別采用甲醇和乙腈沉淀血清中的蛋白，發(fā)現(xiàn)甲醇沉淀處理得到的血中移行成分數(shù)目較多，內(nèi)源性雜志干擾較少，因此提取溶劑選用甲醇。前期考察了15、30、45、60、75、90、105、120 min 共8個采血點，對血清樣本質譜數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)不同的入血成分會出現(xiàn)在不同采血時間點樣本中，然而在60 min 后其入血成分的提取離子流響應較低，因此選擇混合前4 個取血點的血樣進行分析。

大多數(shù)中藥口服給藥后，移行入血的成分才可能發(fā)揮藥效，通過分析口服給藥后血清中的入血成分來確定中藥于體內(nèi)直接作用物質，已成為確定中藥藥效物質基礎的有效途徑。本文基于HPLC?Q?TOF／MS 對麝香通心滴丸進行血清藥物化學研究，通過與對照品比對鑒定出8 個成分，文獻［21?22］報道，沙蟾毒精、遠華蟾毒精、脂蟾毒配基、蟾毒靈等均具有一定強心的作用。

圖14 入血成分與疾病交集靶點GO 富集

圖15 KEGG 通路富集

表3 有效成分與核心靶點的分子對接

圖16 去乙酰華蟾毒精與MAPK1 的分子對接細節(jié)圖

Pharm Mapper 是預測化合物生物活性，并建立相應的公共網(wǎng)絡服務器［23］。本研究通過該服務器，采用反向藥效團匹配方法得到虛擬篩選結果，并與GeneCards 數(shù)據(jù)庫中治療冠心病相關的靶點相結合，得到134 個作用靶點，通過David 數(shù)據(jù)庫對其進行KEGG 通路分析，發(fā)現(xiàn)這8 種入血成分有較多基因靶點有富集在與冠心病相關的通路上。通過Autodock Vina［24］對上述入血成分與核心靶基因進行分子對接，結果顯示入血成分與核心靶點結合性較好。

冠心病是冠狀動脈發(fā)生動脈粥樣硬化，導致血管腔狹窄甚至阻塞，造成心肌缺血、缺氧而導致的心臟病。細胞凋亡是冠心病病理過程的重要因素，抗凋亡基因Bcl?2 和促凋亡基因Bax 共同參與［25］，ErbB signaling pathway 通路與細胞凋亡密切相關，其中Bcl?2 家族在內(nèi)源性凋亡過程中起重要調(diào)控作用［26］。研究表明心肌細胞心肌缺血損傷后可通過活化ErbB signaling pathway 通路，誘導內(nèi)源性Nrg?1 下調(diào)促凋亡分子Bax 表達，減輕細胞由于缺氧復氧而造成氧化應激的損傷。Lin 等［27］通過Na2S2O4誘導H9c2 細胞氧化應激后，在細胞培養(yǎng)液中加入一定濃度的麝香通心滴丸后，結果表明麝香通心滴丸顯著提高了Na2S2O4處理誘導的H9c2 心肌細胞的活力并抑制了其異常形態(tài)學變化麝香通心滴丸預處理可減輕Na2S2O4引起的缺氧損傷，下調(diào)H9c2 細胞凋亡前Bax 的表達，并上調(diào)抗凋亡Bcl?2 的表達。

麝香通心滴丸具有調(diào)節(jié)過PPAR 信號通路的潛在作用。PPAR 信號通路對冠心病的發(fā)展和糖代謝起著重要的調(diào)節(jié)作用。PPAR 主要有PPARα、PPARβ 和PPARγ 三種表型。研究表明，PPARα 和PPARγ 的激活能通過抑制血管內(nèi)皮炎癥反應，抑制細胞增殖和遷移，抑制單核細胞轉化成泡沫細胞，減少血管細胞黏附分子?1、ICAM1 表達等多個方面，發(fā)揮治療冠心病的作用［28］。PPAR?γ 對糖代謝的調(diào)節(jié)主要是增加外周組織對胰島素的敏感性，從而改善胰島素抵抗［29］。本研究發(fā)現(xiàn)PPAR 信號通路上有麝香通心滴丸與冠心病的 共同靶 點PPARA、APOA2、PPARD、RXRB、RXRA、PPARG、FABP3、MMP1、FABP5、NR1H3，因此，推測麝香通心滴丸可能通過調(diào)節(jié)PPAR 信號通路，改善胰島素抵抗來治療冠心病。

血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是調(diào)節(jié)生理或病理的血管新生及增加血管通透性的一個重要細胞因子，它與內(nèi)皮細胞上的受體結合后會提高微血管的通透性，導致大量的炎性細胞滲入肺間質并產(chǎn)生膠原酶降解內(nèi)皮下基底膜及細胞外基質，進而促進內(nèi)皮細胞增生遷移，從而形成新生血管［30］。VEGFR2 是VEGF 的主要功能受體，其與VEGF 相結合主要介導血管的生成，VEGF／VEGFR2 信號通路是VEGF 信號通路中的主要信號通路，可促進血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移、分化，同時抑制其調(diào)亡。VEGF 是血管生成過程中具有關鍵性的生長因子，可以增加血管密度，促進缺氧區(qū)甚至無血管區(qū)域內(nèi)皮細胞增殖，誘導缺血組織內(nèi)的血管新生，是目前臨床上已知的最強的內(nèi)皮細胞有絲分裂原，可有效促進心肌重塑［31］，本研究發(fā)現(xiàn)VEGF signaling pathway 通路上有麝香通心滴丸與冠心病的共同靶點PIK3CG、CDC42、MAPK1、MAP2K1、MAPK14、PLA2G2A、RAF1、SRC、PIK3R1、KDR、AKT2，因此推測麝香通心滴丸可能通過調(diào)節(jié)VEGF signaling pathway 通路來治療冠心病。

綜上所述，本研究基于血清藥物化學與網(wǎng)絡藥理學，在體內(nèi)化學成分分析辨識的基礎上通過關聯(lián)網(wǎng)絡構建及分析，初步闡釋了麝香通心滴丸治療冠心病作用機制，可為中藥藥效物質基礎分析及其相關作用機制探究提供一定依據(jù)。