洪 萌 李權達 石榮先

（河南大學第一附屬醫(yī)院眼科， 河南 開封475000）

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥之一，是患者致盲的重要原因之一，嚴重影響患者的健康和生活質量［1］，近年來，中醫(yī)藥對DR 的治療取得了一定的療效，可從多環(huán)節(jié)、多靶點防治［2］。異甘草素是甘草中的異黃酮類化合物，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等作用，適宜劑量下可保護糖尿病心肌病大鼠，維持心肌功能、代謝及心肌細胞結構正常［3］，在體外能夠抑制骨肉瘤細胞MG?63 的增殖與侵襲［4］；甘草黃酮可以抑制高糖誘導的人眼視網(wǎng)膜上皮細胞氧化損傷及凋亡的發(fā)生，預防糖尿病性視網(wǎng)膜病變［5］。血管內(nèi)皮細胞生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）為VEGF 家族成員之一，是與微血管新生功能相關的生長因子，與DR 的發(fā)生發(fā)展密切相關［6］，高遷移率族蛋白A1（high mobility group protein A1，HMGA1）通過下調(diào)VEGFA 表達來預防糖尿病性視網(wǎng)膜增生［7］，有研究發(fā)現(xiàn)中藥聯(lián)合激光降低DR 患者VEGF 水平可延緩糖尿病視網(wǎng)膜病變的病情發(fā)展［8］；核因子?κB（Nuclear factor κB，NF?κB）信號通路也與DR的發(fā)生有關，可阻斷該信號通路對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜起保護作用［9］，異甘草素能通過抑制NF?κB 信號通路抑制人肺癌H460 細胞的增殖和誘導細胞周期阻滯，并促進其凋亡［10］。然而，異甘草素對糖尿病視網(wǎng)膜病變的影響及其機制是否與VEGFA 和NF?κB 信號通路有關還尚未清楚。本實驗用高糖處理人視網(wǎng)膜上皮細胞ARPE?19 建立糖尿病視網(wǎng)膜病變模型，研究異甘草素對高糖誘導的ARPE?19細胞增殖和遷移的影響及其機制與VEGFA 和NF?κB 信號通路的關系。

1 材料

1.1 細胞 人視網(wǎng)膜上皮細胞系ARPE?19，購自美國菌種保藏中心（ATCC）。

1.2 試劑與藥物 DMEM／F12 培養(yǎng)基（貨號SH30243.01）、胎牛血清（貨號SV30087.02）、胰蛋白酶（貨號SH30042.01）購自美國Hyclone 公司；葡萄糖（貨號G116304）購自河北圣雪葡萄糖有限公司；異甘草素（貨號B21525?20 mg，純度98%）購自上海源葉生物科技有限公司；四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）試劑盒（貨號C0009）、二辛可寧酸（BCA）試劑盒（貨號P0012S）、ECL化學發(fā)光液（貨號P0018S）、聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）（貨號FFP39）、十二烷基硫酸鈉、鈉鹽?聚丙烯酰胺凝膠電泳（dodecyl sulfate，sodium salt?Polyacrylamide gel electrophoresis，SDS?PAGE）試劑盒（貨號P0690）購自碧云天生物技術研究所；MMP2（貨號250752）、MMP9（貨號250755）抗體購自美國Abbiotec 公司；VEGFA（貨號PL0502017）、Cyclin D1（貨號PL0502539）購自加拿大Pllabs 公司；p?p65（貨號HZ?22488）購自美 國Santa 公 司；p?IκBα 一抗抗體（貨號bs?18128R?2）購自上海玉博生物科技有限公司；山羊抗兔IgG?HRP（貨號AAT?16793）購自美 國 AAT Bioquest 公 司；Transwell 小室（貨號353090）購于美國BD 公司；LipofectamineTM 2000 轉染試劑盒（貨號11668?027）美國Invitrogen 公司；熒光定量試劑盒（貨號218073）購自德國Qiagen 公司；載體質粒購自北京普瑞金科技有限公司。

1.3 儀器 Thermo FC 酶標儀購自美國Thermo 公司；LightCycler480 熒光定量PCR 儀購自上海仁科生物科技有限公司；熒光倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 人視網(wǎng)膜上皮細胞系ARPE?19 常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM／F12 培養(yǎng)基中，于含5% CO2的37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，每1～2 d 換1 次新鮮培養(yǎng)液，細胞融合至90%左右時進行消化傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

2.2 細胞處理與分組 取正常培養(yǎng)細胞于6 孔板培養(yǎng)，細胞貼壁且狀態(tài)良好時更換為葡萄糖濃度為25 mmol／L 的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，作為高糖組；取正常培養(yǎng)的細胞，作為對照組；用濃度分別為30、60、120 μmol／L 的異甘草素處理ARPE?19 細胞24 h，再用25 mmol／L 的葡萄糖處理24 h，作為不同濃度異甘草素處理組；將si?con、si?VEGFA 轉染至ARPE?19 細胞后用25 mmol／L 葡萄糖處理24 h，作為高糖＋si?con 組、高 糖＋si?VEGFA 組；將pcDNA?con、pcDNA?VEGFA 轉染至ARPE?19 細胞后用60 μmol／L的異甘草素處理24 h，再用25 mmol／L的葡萄糖處理24 h，作為高糖＋異甘草素＋pcDNA?con 組、高糖＋異甘草素＋pcDNA?VEGFA 組。

2.3 MTT 試劑盒檢測細胞存活率 各組細胞培養(yǎng)48 h 后，分別加入5 mg／mL MTT 溶液20 μL，在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO 振蕩反應15 min，酶標儀檢測490 nm波長處光密度（OD），細胞存活率＝（OD實驗組／OD對照組）×100%。實驗重復3 次，每次3 個復孔。

2.4 Western blot 檢測蛋白表達 各組細胞培養(yǎng)48 h后提取總蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度。取50 μg 總蛋白，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠轉至PVDF上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，再分別加入一抗（MMP2、MMP9、VEGFA、CyclinD1、p?p65、p?IκBα），4 ℃孵育過夜，Tris 鹽吐溫緩沖液（Tris Buffer Solution Tween，TBST）洗膜，加入二抗室溫孵育90 min，TBST 洗滌3 次，ECL 化學發(fā)光液顯像，Quantity One 凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的灰度值，蛋白相對表達量＝目的條帶灰度值／β?actin 條帶灰度值。每個蛋白樣品重復3 次。

2.5 Transwell 實驗檢測細胞遷移 取200 μL 細胞懸液種于Transwell 小室上室，下室加入500 μL 含10%胎牛血清的DMEM／F12 培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)24 h后用4% 多聚甲醛固定，再用0.1% 結晶紫染色，顯微鏡觀察并隨機選取5 個視野拍照計數(shù)，計算結晶紫染色細胞數(shù)，即為遷移細胞數(shù)。

2.6 RT?PCR 檢測VEGFAmRNA 表達 各組細胞培養(yǎng)48 h 后提取總RNA，再反轉錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒使用說明進行PCR，每個樣品3 個重復，反應總體系20 μL，其中SYBR 9 μL，正、反向引物各0.5 μL，cDNA 0.5 μL，H2O 9.5 μL。循環(huán)條件為95 ℃3 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共40 個循環(huán)，60 ℃延長5 min，相對表達量用2-△△ct計算。以β?actin 為內(nèi)參，VEGFA正向5′?CCAGCAGAAAGAGGAAAGAGGTAG?3′，反向5′?CCCCAA AAGCAGGTCACTCAC?3′；β?actin 正向5′?CTCCATCCTGGCCTCGCTGT?3′，反向5′?GCT?GTCACCTTCACCGTTCC?3′。

2.7 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 20.0 軟件進行處理，計量資料以（）表示，2 組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 不同濃度異甘草素對人視網(wǎng)膜上皮細胞ARPE?19 增殖的影響 與對照組比較，葡萄糖處理后人視網(wǎng)膜上皮細胞ARPE?19 的存活率升高（P＜0.05）；與高糖組比較，不同濃度異甘草素組人視網(wǎng)膜上皮細胞ARPE?19 的存活率降低（P＜0.05），見表1。

表1 不同濃度異甘草素對人視網(wǎng)膜上皮細胞ARPE?19 增殖的影響（， n＝9）Tab.1 Effects of isoliquiritigenin at different concentrations on the proliferation of ARPE?19 cells（， n＝9）

表1 不同濃度異甘草素對人視網(wǎng)膜上皮細胞ARPE?19 增殖的影響（， n＝9）Tab.1 Effects of isoliquiritigenin at different concentrations on the proliferation of ARPE?19 cells（， n＝9）

注：與對照組比較，?P＜0.05；與高糖組比較，＃P＜0.05。

3.2 不同濃度異甘草素對人視網(wǎng)膜上皮細胞ARPE?19 遷移的影響 與對照組比較，葡萄糖處理后人視網(wǎng)膜上皮細胞ARPE?19 中MMP2、MMP9表達和遷移細胞數(shù)升高（P＜0.05）；與葡萄糖處理組比較，不同濃度異甘草素組人視網(wǎng)膜上皮細胞ARPE?19 中MMP2、MMP9 表達和遷移細胞數(shù)降低（P＜0.05），見表2、圖1。

表2 不同濃度異甘草素對人視網(wǎng)膜上皮細胞ARPE?19 遷移的影響（， n＝9）Tab.2 Effectsof isoliquiritigenin at different concentrations on the migration of ARPE?19 cells（， n＝9）

表2 不同濃度異甘草素對人視網(wǎng)膜上皮細胞ARPE?19 遷移的影響（， n＝9）Tab.2 Effectsof isoliquiritigenin at different concentrations on the migration of ARPE?19 cells（， n＝9）

注：與對照組比較，?P＜0.05；與高糖組比較，＃P＜0.05。

圖1 不同濃度異甘草素對人視網(wǎng)膜上皮細胞ARPE?19 遷移的影響Fig.1 Effects of isoliquiritigenin at different concentrations on migration of ARPE?19 cells

3.3 異甘草素對VEGFA 表達的影響 與對照組比較，葡萄糖處理后人視網(wǎng)膜上皮細胞ARPE?19中VEGFA 蛋白和mRNA 表達升高（P＜0.05）；與高糖組比較，高糖＋60 μmol／L 異甘草素組人視網(wǎng)膜上皮細胞ARPE?19 中VEGFA 蛋白和mRNA 表達降低（P＜0.05），見圖2、表3。

圖2 Western Blot 檢測VEGFA 蛋白表達Fig.2 Detection of VEGFA protein expression by Western blot

3.4 低表達VEGFA 對人視網(wǎng)膜上皮細胞ARPE?19 增殖和遷移的影響 與對照組比較，葡萄糖處理后人視網(wǎng)膜上皮細胞ARPE?19 中VEGFA、CyclinD1、MMP2、MMP9 表達，細胞存活率和遷移細胞數(shù)升高（P＜0.05）；與高糖＋si?con 組比較，高糖＋si?VEGFA 組人視網(wǎng)膜上皮細胞ARPE?19 中VEGFA、CyclinD1、MMP2、MMP9 表達，細胞存活率和遷移細胞數(shù)降低（P＜0.05），見圖3、表4。

表3 異甘草素對VEGFA 表達的影響（， n＝9）Tab.3 Effect of isoliquiritigenin on VEGFA expression（， n＝9）

表3 異甘草素對VEGFA 表達的影響（， n＝9）Tab.3 Effect of isoliquiritigenin on VEGFA expression（， n＝9）

注：與對照組比較，?P＜0.05；與高糖組比較，＃P＜0.05。

圖3 Western blot 檢 測VEGFA、CyclinD1、MMP2、MMP9 蛋白表達（Ⅰ）Fig.3 Detection of VEGFA，CyclinD1，MMP2 and MMP9 protein expressions by Western blot（Ⅰ）

3.5 高表達VEGFA 可以部分逆轉異甘草素對人視網(wǎng)膜上皮細胞ARPE?19 增殖和遷移的抑制作用與高糖組比較，高糖＋異甘草素組人視網(wǎng)膜上皮細 胞 ARPE?19 中 VEGFA、CyclinD1、MMP2、MMP9 表達，細胞存活率和遷移細胞數(shù)降低（P＜0.05）；與高糖＋異甘草素＋pcDNA?con 組比較，高糖＋異甘草素＋pcDNA?VEGFA 組人視網(wǎng)膜上皮細胞ARPE?19 中VEGFA、CyclinD1、MMP2、MMP9 表達，細胞存活率和遷移細胞數(shù)升高（P＜0.05），見圖4、表5。

表4 低表達VEGFA 對人視網(wǎng)膜上皮細胞ARPE?19 增殖和遷移的影響（， n＝9）Tab.4 Effects of low VEGFA expression on the proliferation and migration of ARPE?19 cells（， n＝9）

表4 低表達VEGFA 對人視網(wǎng)膜上皮細胞ARPE?19 增殖和遷移的影響（， n＝9）Tab.4 Effects of low VEGFA expression on the proliferation and migration of ARPE?19 cells（， n＝9）

注：與對照組比較，?P＜0.05；與高糖＋si?con 組比較，＃P＜0.05。

3.6 NF?κB 信號通路相關蛋白的表達 與高糖組比較，高糖＋異甘草素組人視網(wǎng)膜上皮細胞ARPE?19 中p?p65、p?IκBα 表達降低（P＜0.05）；與高糖＋異甘草素＋pcDNA?con 組比較，高糖＋異甘草素＋pcDNA?VEGFA 組人視網(wǎng)膜上皮細胞ARPE?19 中p?p65、p?IκBα 表達升高（P＜0.05），見圖5、表6。

4 討論

圖4 Western blot 檢測VEGFA、CyclinD1、MMP2、MMP9 蛋白表達（Ⅱ）Fig.4 Detection of VEGFA，CyclinD1，MMP2 and MMP9 protein expressions by Western blot（Ⅱ）

表5 高表達VEGFA 可以部分逆轉異甘草素處理的人視網(wǎng)膜上皮細胞ARPE?19 增殖和遷移（， n＝9）Tab.5 High VEGFA expression partially reversed proliferation and migration of isoliquiritigenin?treated ARPE?19 cells（， n＝9）

表5 高表達VEGFA 可以部分逆轉異甘草素處理的人視網(wǎng)膜上皮細胞ARPE?19 增殖和遷移（， n＝9）Tab.5 High VEGFA expression partially reversed proliferation and migration of isoliquiritigenin?treated ARPE?19 cells（， n＝9）

注：與高糖組比較，?P＜0.05；與高糖＋異甘草素＋pcDNA?con 組比較，＃P＜0.05。

圖5 Western blot 檢測p?p65、p?IκBα 的蛋白表達Fig.5 Detection of p?p65 and p?IκBα protein expres?sions by Western blot

表6 NF?κB 信號通路相關蛋白的表達（， n＝9）Tab.6 Expressions of NF?κB signaling pathway?associated proteins（， n＝9）

表6 NF?κB 信號通路相關蛋白的表達（， n＝9）Tab.6 Expressions of NF?κB signaling pathway?associated proteins（， n＝9）

注：與高糖組比較，?P ＜0.05；與高糖＋異甘草素＋pcDNA?con組，＃P＜0.05。

DR 的發(fā)病機理尚未完全清楚，病變晚期以增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變形成為主，在視網(wǎng)膜增殖性病變的增生膜中有多種細胞參與，其中視網(wǎng)膜色素上皮細胞的增生遷移在增殖性病變中起重要作用，高糖可促進視網(wǎng)膜色素上皮細胞增生［11］。本實驗用高糖處理人視網(wǎng)膜上皮細胞系ARPE?19，結果顯示高糖誘導的人視網(wǎng)膜上皮細胞ARPE?19 存活率顯著升高，MMP2、MMP9 蛋白表達顯著升高，細胞遷移數(shù)量顯著升高，說明高糖確實促進了ARPE?19 細胞增殖和遷移。有研究發(fā)現(xiàn)異甘草素可以抑制腎透明細胞癌786?O 細胞的增殖、遷移和侵襲，并通過磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinos?itol?3?kinase，PI3K）／蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）／哺乳動物雷帕霉素蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路誘導細胞自噬［12］，異甘草素可通過調(diào)控PI3k／Akt 信號通路抑制小兒血管瘤內(nèi)皮細胞的生長和侵襲，誘導細胞周期阻滯，并促進細胞凋 亡［13］，還可通過下調(diào)MMP2 和MMP9 的表達抑制膠質瘤干細胞遷移和侵襲［14］。本實驗結果顯示，經(jīng)異甘草素處理的高糖誘導ARPE?19 細胞中細胞存活率，MMP2、MMP9蛋白表達和細胞遷移數(shù)顯著降低，說明異甘草素可以抑制ARPE?19 細胞增殖和遷移，預防視網(wǎng)膜病變。

VEGF 高表達可促進血管的異常生長，影響DR 的發(fā)生［15］。VEGFA 是VEGF 成員之一，是促血管生成因子，在促進內(nèi)皮細胞的存活、遷移和增殖以及增強血管通透性中發(fā)揮作用，可下調(diào)VEGFA 來減輕DR 的發(fā)展［16］，同時miR?195?5p 能通過靶向VEGFA 抑制宮頸癌HeLa 細胞侵襲和轉移［17］。本實驗結果顯示，高糖誘導的人視網(wǎng)膜上皮細胞ARPE?19 中VEGFAmRNA 和蛋白表達升高，進一步轉染si?VEGFA 后發(fā)現(xiàn)，ARPE?19 細胞中CyclinD1、MMP2、MMP9 蛋白表達，細胞存活率和細胞遷移數(shù)量降低，說明VEGFA 低表達可抑制ARPE?19 細胞增殖和遷移；經(jīng)異甘草素處理后，VEGFAmRNA 和蛋白表達降低，說明該成分可下調(diào)VEGFA 表達，從而抑制ARPE?19 細胞增殖和遷移。

NF?κB 信號通路與糖尿病血管并發(fā)癥有關，糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血清中其表達顯著增加［18］，銀杏葉提取物可通過抑制NF?κB 活性抑制視網(wǎng)膜色素上皮細胞炎癥反應，保護視網(wǎng)膜色素上皮細胞，防治糖尿病視網(wǎng)膜病變［19］；柚皮苷能通過抑制炎癥，氧化應激和NF?κB 活化來減輕糖尿病性視網(wǎng)膜病變［20］。本實驗結果顯示，異甘草素處理后高糖誘導的ARPE?19 細胞中p?p65、p?IκBα 表達降低，說明該成分可抑制NF?κB 信號通路的激活，而過表達VEGFA 逆轉了它對高糖誘導p?p65、p?IκBα 表達的抑制作用，可能通過VEGFA 影響NF?κB 信號通路。

綜上所述，異甘草素可抑制高糖誘導的ARPE?19 細胞增殖和遷移，其機制可能與VEGFA及NF?κB 信號通路有關，可為糖尿病視網(wǎng)膜病變的防治提供新方法。