胡雅清 陳騰祥 張金娟 謝 青 張晨宇 朱曼荊 謝 甦?

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng)550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院， 貴州 貴陽(yáng)550004）

如今癌癥已成為威脅人類生存和社會(huì)發(fā)展的主要疾病之一，在不同地域不同人群中，乳腺癌也都是備受關(guān)注的主要癌癥。在全球著名學(xué)術(shù)刊物《CA：A Cancer Journal for Clinicians》 發(fā)布的美國(guó)2018 年癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告中顯示，女性新發(fā)癌癥病例的30%都是乳腺癌，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其他癌癥，同時(shí)我國(guó)國(guó)家癌癥中心發(fā)布的癌癥負(fù)擔(dān)最新結(jié)果表明，乳腺癌也位居女性癌癥發(fā)病率首位［1］。鱉甲?莪術(shù)藥對(duì)是國(guó)醫(yī)大師劉尚義治療惡性腫瘤的常用組合，使用頻次最多，達(dá)1 201 次，已有十余年臨床應(yīng)用實(shí)踐，但尚缺乏分子水平藥理學(xué)研究［2?4］。鱉甲味咸、性微寒，歸肝腎經(jīng)，能滋陰潛陽(yáng)、退熱除蒸、善于軟堅(jiān)散結(jié)［5］；莪術(shù)味辛、苦，性溫，歸肝、脾經(jīng)，有行氣破血、消積止痛之功效［6］；鱉甲味咸而補(bǔ)益屬陰，莪術(shù)味辛而走散屬陽(yáng)；鱉甲滋陰散結(jié)，莪術(shù)行氣破血，兩藥合用，一補(bǔ)一攻、寒溫相宜、陰陽(yáng)相適、為消積聚癥瘕之要藥［7］。本實(shí)驗(yàn)基于Wnt／β?catenin 信號(hào)通路，探討鱉甲?莪術(shù)藥對(duì)含藥血清對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 MCF?7 人乳腺癌細(xì)胞株，由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供。

1.2 動(dòng)物 SPF 級(jí)雌性SD 大鼠55 只，體質(zhì)量220～260 g，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2014?0011，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)43006700016478。

1.3 藥物 醋鱉甲顆粒劑（批號(hào)8127093）、莪術(shù)顆粒劑（批號(hào)8071933）均購(gòu)自廣東一方制藥有限公司。

1.4 試劑 DMEM 培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司，貨號(hào)8119234）；胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司，貨號(hào)19080505）；BD Pharmingen 流式周期試劑盒（美國(guó)Sigma 公司，貨號(hào)9039585）；噻唑藍(lán)（MTT，北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)725c056）；胰蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)2046777）；青鏈霉素混合液（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)J190003）；5?氟尿嘧啶MB1273（大連美侖生物有限公司，貨號(hào)s0808a）；Anti?Cyclin D1 抗 體（英 國(guó) Abcam 公 司，貨 號(hào)GR3212345?11，稀釋倍數(shù)1／10 000）；Anti?c?Myc抗體（英國(guó)Abcam 公司，貨號(hào)GR3232703?2，稀釋倍數(shù)1／1 000）；Anti?beta Catenin 抗體（英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)GR184212?61，稀釋倍數(shù)1／5 000）。

1.5 儀器 SW?CJ?2FD 超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；Model 310 恒溫CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo 公司）；CKX41 倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；16K 臺(tái)式自動(dòng)離心機(jī)（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）；Allegra 64R Centrifuge 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter 公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek 公 司）；EPICL XL 型流式細(xì)胞儀（美 國(guó)Beckman Coulter 公司）；ChemiDoc MP 凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio?Rad 公司）；MiniVE 電泳儀（美國(guó)GE 公司）；全自動(dòng)雪花制冰機(jī)IMS?40（常熟市雪科電器有限公司）；MDF?382E 超低溫冰箱（日本SANYO 公司）；KS130B 脫色搖床（德國(guó)IKA 公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞株MCF?7 于含10%胎牛血清的DEME 培養(yǎng)基中，再將其置于5%CO2、37 ℃、飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日換液，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到70%～80% 時(shí)，可進(jìn)行消化傳代或用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 藥物血清制備 將大鼠隨機(jī)分鱉甲組、莪術(shù)組、鱉甲?莪術(shù)藥對(duì)組各10 只，空白組25 只，以給藥劑量為其等效劑量的20 倍計(jì)算，確定鱉甲給藥劑量為3 g／kg，莪術(shù)給藥劑量為1.5 g／kg，鱉甲?莪術(shù)藥對(duì)給藥劑量為4.5 g／kg，每天2 次，連續(xù)7 d。最后1 次給藥前大鼠禁食不禁水12 h，給藥后2 h 水合氯醛麻醉，心尖取血，2 000 r／min 離心15 min 取血清，同組混合以消除個(gè)體差異，56 ℃下滅活30 min，0.22 μm 過(guò)濾除菌，-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 細(xì)胞分組 正常MCF?7 細(xì)胞分為空白血清組（10%空白血清＋90%DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)）、鱉甲低劑量組（2.5% 鱉甲血清＋7.5% 空白血清＋90%DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)）、鱉甲中劑量組（5% 鱉甲血清＋5%空白血清＋90%DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)）、鱉甲高劑量組（10% 鱉甲血清＋90% DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)）、莪術(shù)低劑量組（2.5% 莪術(shù)血清＋7.5% 空白血清＋90% DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)）、莪術(shù)中劑量組（5%莪術(shù)血清＋5%空白血清＋90%DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)）、莪術(shù)高劑量組（10%莪術(shù)血清＋90%DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)）、鱉甲?莪術(shù)藥對(duì)低劑量組（2.5%鱉甲?莪術(shù)藥對(duì)血清＋7.5%空白血清＋90%DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)）、鱉甲?莪術(shù)藥對(duì)中劑量組（5%鱉甲?莪術(shù)藥對(duì)血清＋5% 空白血清＋90% DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)）、鱉甲?莪術(shù)藥對(duì)高劑量組（10%鱉甲?莪術(shù)藥對(duì)血清＋90%DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)）、陽(yáng)性對(duì)照組（10% 空白血清＋90% DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)＋10 mg／mL 氟尿嘧啶）。

2.4 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF?7 細(xì)胞，取100 μL 濃度為1 × 105／ mL 者接種于96 孔培養(yǎng)板中，每組5 個(gè)復(fù)孔，1 d 后加入饑餓培養(yǎng)液饑餓24 h 使細(xì)胞同步化，換不同劑量10%空白血清培養(yǎng)基、鱉甲血清培養(yǎng)基、莪術(shù)血清培養(yǎng)基、鱉甲?莪術(shù)藥對(duì)血清培養(yǎng)基和含10 mg／mL 陽(yáng)性藥的空白血清培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)48、72 h。培養(yǎng)結(jié)束后，于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)在96 孔板中加入MTT 溶液20 μL，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入二甲基亞砜（DM?SO）150 μL，37 ℃下振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，于490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定光密度（OD），計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，公式為抑制率＝（1-OD實(shí)驗(yàn)組／OD對(duì)照組）× 100%，重復(fù)3 次。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MCF?7 細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF?7 細(xì)胞，取1 mL 濃度為1 × 105／mL 者接種于6 孔培養(yǎng)板中，1 d 后加入饑餓培養(yǎng)液饑餓24 h 使細(xì)胞同步化，換不同劑量10% 的空白血清培養(yǎng)基、鱉甲血清培養(yǎng)基、莪術(shù)血清培養(yǎng)基、鱉甲?莪術(shù)藥對(duì)血清培養(yǎng)基和含10 mg／mL 陽(yáng)性藥的空白血清培養(yǎng)基作用48 h，根據(jù)細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

2.6 Western blot 檢測(cè)β?Catenin、c?Myc、cyclin D1 蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF?7 細(xì)胞，取1 mL濃度為1×105／mL 者胞接種于6 孔培養(yǎng)板中，1 d 后加入饑餓培養(yǎng)液饑餓24 h 使細(xì)胞同步化，換不同劑量10%空白血清培養(yǎng)基、鱉甲血清培養(yǎng)基、莪術(shù)血清培養(yǎng)基、藥對(duì)血清培養(yǎng)基和含10 mg／mL陽(yáng)性藥的空白血清培養(yǎng)基作用48 h，棄上清，PBS沖洗3 次，加入適量細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃、15 000 r／min 離心20 min，取上清，BCA 法對(duì)所提總蛋白進(jìn)行定量，規(guī)定上樣量為30 μg，加入Loading Buffer 煮沸變性，10% SDS?PAGE 凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，一抗4 ℃下孵育過(guò)夜，二抗室溫下孵育2 h，ECL 化學(xué)發(fā)光液孵育。凝膠成像系統(tǒng)掃描，并定量分析條帶光密度值。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組含藥血清對(duì)MCF?7 細(xì)胞增殖的影響 與空白血清組比較，各含藥血清組作用48、72 h 后均能抑制MCF?7 細(xì)胞增殖（P＜0.05，P＜0.01）。同一中藥不同劑量的抑制率依次為高劑量組＞中劑量組＞低劑量組，而同一劑量不同中藥抑制率依次為藥對(duì)鱉甲?莪術(shù)含藥血清組＞莪術(shù)含藥血清組＞鱉甲含藥血清組。見(jiàn)表1。

表1 含藥血清對(duì)MCF?7 細(xì)胞增殖的影響（， n＝3）Tab.1 Effect of medicated serum on the proliferation of MCF?7 cells（， n＝3）

表1 含藥血清對(duì)MCF?7 細(xì)胞增殖的影響（， n＝3）Tab.1 Effect of medicated serum on the proliferation of MCF?7 cells（， n＝3）

注：與空白血清組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

3.2 含藥血清對(duì)MCF?7 細(xì)胞周期的影響 與空白血清組比較，各含藥血清組作用48 h 后G0 ／G1 期細(xì)胞比例增加（P＜0.05，P＜0.01），S 期細(xì)胞比例減?。≒＜0.05，P＜0.01），表明各組含藥血清作用MCF?7 細(xì)胞后均可阻止G1／G0 期的細(xì)胞順利進(jìn)入S期及G2 期，從而使MCF?7 細(xì)胞的有絲分裂過(guò)程受到干擾，導(dǎo)致其增殖受到抑制，且趨勢(shì)與MTT 一致。見(jiàn)圖1、表2。

圖1 含藥血清對(duì)MCF?7 細(xì)胞周期的影響Fig.1 Effect of medicated serum on the cell cycle of MCF?7 cells

3.3 含藥血清對(duì)β?Catenin、c?Myc、cyclin D1 蛋白表達(dá)的影響 與空白血清組比較，各含藥血清組作用48 h 后β?Catenin、c?Myc、cyclin D1 表達(dá)均降低（P＜0.05，P＜0.01），表明含藥血清可抑制Wnt／β?catenin 信號(hào)通路中β?catenin 的表達(dá)，下調(diào)靶基因cyclinD1，c?Myc 的表達(dá)，從而抑制MCF?7細(xì)胞增殖。見(jiàn)表3～6、圖2。

表2 含藥血清對(duì)MCF?7 細(xì)胞周期的影響（， n＝3）Tab.2 Effect of medicated serum on the cell cycle of MCF?7 cells（， n＝3）

表2 含藥血清對(duì)MCF?7 細(xì)胞周期的影響（， n＝3）Tab.2 Effect of medicated serum on the cell cycle of MCF?7 cells（， n＝3）

注：與空白血清組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

表3 鱉甲含藥血清對(duì)β?Catenin、c?Myc、cyclin D1 蛋白表達(dá)的影響（， n＝3）Tab.3 Effects of serum medicated with Trionycis Carapax on the protein expressions of β?Catenin，c?Myc and cyclin D1（， n＝3）

表3 鱉甲含藥血清對(duì)β?Catenin、c?Myc、cyclin D1 蛋白表達(dá)的影響（， n＝3）Tab.3 Effects of serum medicated with Trionycis Carapax on the protein expressions of β?Catenin，c?Myc and cyclin D1（， n＝3）

注：與空白血清組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

表4 莪術(shù)含藥血清對(duì)β?Catenin、c?Myc、cyclin D1 蛋白表達(dá)的影響（， n＝3）Tab.4 Effects of serum medicated with Zedoary Turmeric on the protein expressions of β?Catenin，c?Myc and cyclin D1（， n＝3）

表4 莪術(shù)含藥血清對(duì)β?Catenin、c?Myc、cyclin D1 蛋白表達(dá)的影響（， n＝3）Tab.4 Effects of serum medicated with Zedoary Turmeric on the protein expressions of β?Catenin，c?Myc and cyclin D1（， n＝3）

注：與空白血清組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

4 討論

西醫(yī)認(rèn)為，乳腺癌發(fā)病涉及多個(gè)因素的影響，該病的發(fā)生與生育史、性腺激素刺激、家族遺傳史等因素有關(guān)；中醫(yī)認(rèn)為，正氣不足是乳腺癌發(fā)病的根本原因，情志因素是乳腺癌發(fā)病的重要誘因，正氣不足、情志內(nèi)傷會(huì)引發(fā)臟腑功能嚴(yán)重異常，由于肝臟、腎臟、脾功能失調(diào)使氣血運(yùn)行紊亂，長(zhǎng)期如此，痰瘀交阻于乳絡(luò)，從而導(dǎo)致乳癌的發(fā)生［8?9］，癌毒耗損機(jī)體正氣，日久則導(dǎo)致氣陰兩虛、痰瘀交阻。針對(duì)這一病理機(jī)制，劉老提出“陰陽(yáng)雙消、滋陰起亟” 的治療理念，并在此基礎(chǔ)上以鱉甲?莪術(shù)藥對(duì)為君藥臨床治療乳腺癌上萬(wàn)例，療效顯著，可使患者獲得較好的生存質(zhì)量及較長(zhǎng)的生存周期。

表5 鱉甲?莪術(shù)藥對(duì)含藥血清對(duì)β?Catenin、c?Myc、cyclin D1 蛋白表達(dá)的影響（， n＝3）Tab.5 Effects of serum medicated with Trionycis?Carapax Zedoary Turmeric on the protein expressions of β?Catenin，c?Myc and cyclin D1（， n＝3）

表5 鱉甲?莪術(shù)藥對(duì)含藥血清對(duì)β?Catenin、c?Myc、cyclin D1 蛋白表達(dá)的影響（， n＝3）Tab.5 Effects of serum medicated with Trionycis?Carapax Zedoary Turmeric on the protein expressions of β?Catenin，c?Myc and cyclin D1（， n＝3）

注：與空白血清組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

表6 各組高劑量含藥血清對(duì)β?Catenin、c?Myc、cyclin D1 蛋白表達(dá)的影響（， n＝3）Tab.6 Effects of each group treated with high?dose medicated serum on the protein expressions of β?Catenin，c?Myc and cyclin D1（， n＝3）

表6 各組高劑量含藥血清對(duì)β?Catenin、c?Myc、cyclin D1 蛋白表達(dá)的影響（， n＝3）Tab.6 Effects of each group treated with high?dose medicated serum on the protein expressions of β?Catenin，c?Myc and cyclin D1（， n＝3）

注：與空白血清組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

目前，血清藥理學(xué)是研究中藥復(fù)方抗腫瘤作用的有效方法，也是從細(xì)胞分子水平研究中藥藥理學(xué)的新手段［10］，故本實(shí)驗(yàn)以其為理論指導(dǎo)探討鱉甲?莪術(shù)藥對(duì)含藥血清治療乳腺癌的機(jī)制。

圖2 Western blot 檢測(cè)β?Catenin、c?Myc、cyclin D1 蛋白表達(dá)Fig.2 Protein expressions of β?Catenin，c?Myc and cyclin D1 by Western blot

乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展與Wnt 信號(hào)通路功能失調(diào)有密切的關(guān)系，cyclin D1、c?Myc 是Wnt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中至關(guān)重要的靶基因［11?12］，研究表明抑癌基因失活和癌基因的激活可異常激活Wnt／β?catenin 信號(hào)通路，β?catenin 降解障礙可導(dǎo)致c?Myc等靶基因激活及細(xì)胞周期調(diào)控出現(xiàn)異常，從而導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生［13］。cyclin D1 作為調(diào)控細(xì)胞周期G1期的關(guān)鍵蛋白之一，其過(guò)度表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞由G1 期進(jìn)入S 期，促進(jìn)細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換速度的加快，最終引起細(xì)胞增殖失控，導(dǎo)致癌變［14］。c?Myc 基因既可刺激細(xì)胞增殖又可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞由G1 期進(jìn)入S 期完成的，高水平的c?Myc mRNA 可加快細(xì)胞進(jìn)入S 期的速度，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［15］。

綜上所述，各組含藥血清均可抑制MCF?7 細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，其抗乳腺癌的機(jī)制可能與下調(diào)β?catenin 及β?catenin 下游靶基因cyclin D1、c?Myc 蛋白表達(dá)，阻止G1／G0 期的細(xì)胞順利進(jìn)入S期及G2 期，導(dǎo)致其增殖受到抑制有關(guān)。此外，鱉甲?莪術(shù)藥對(duì)的抑制作用高于單味藥，可能是配伍后相得益彰，間接輔助某一功能發(fā)揮，從而發(fā)揮協(xié)同增效的作用［16］。由于乳腺癌形成的機(jī)制十分復(fù)雜，涉及多種細(xì)胞、細(xì)胞因子以及多條信號(hào)通路，因此鱉甲?莪術(shù)藥對(duì)含藥血清抗乳腺癌作用及其機(jī)制仍需進(jìn)行大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)作進(jìn)一步探討。