王 志 謝建絮 李婉斯 葛泓鈺 張永太 馮年平?

（1.上海中醫(yī)藥大學， 上海201203； 2.上海市第十人民醫(yī)院， 上海200072）

西黃丸出自《外科證治全生集·卷四》，由牛黃、麝香、乳香、沒藥4 味藥材組成，用于治療癰疽瘡毒、惡性腫瘤［1?2］，方中麝香味辛，性溫，芳香而通經絡，為主藥。課題組前期根據(jù)藥味用量、藥理作用、化學成分，對西黃丸進行了提取精制，發(fā)現(xiàn)經超臨界CO2萃取后所得西黃方活性組分的抗腫瘤作用與原制劑相近，并且在減量（每天服用量約為原處方量的1／15）的同時未減效。

本實驗以麝香主要活性成分麝香酮為指標，將從藥動學角度探討西黃方配伍的協(xié)同作用，同時比較方中麝香在正常、乳腺癌癌前病變大鼠體內藥動學的差異，以期為探索其配伍機制、開發(fā)相關新劑型提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥物麝香酮（批號 110719?201215）、正十七烷（批號51578）對照品（中國食品藥品檢定研究院）；7，12?二甲基苯并蒽（DMBA，美國Sigma 公司，批號D3254）；肝素鈉注射液（上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司，批號151802020A）；醋酸甲羥孕酮片（上海信誼天平藥業(yè)有限公司，批號170611）；戊酸雌二醇片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號372A）。人工麝香（北京聯(lián)馨藥業(yè)有限公司，批號2016VR116）；體外培育牛黃（武漢健民大鵬藥業(yè)有限公司，批號170701）；乳香、沒藥（上海虹橋藥業(yè)有限公司中藥飲片廠），以上藥材均經上海中醫(yī)藥大學中藥學院生藥學教研室吳靳榮副教授鑒定為正品。西黃方為自制（根據(jù)2015 年版《中國藥典》 西黃丸處方，稱取體外培育牛黃、人工麝香各15 g，粉碎成細粉后過60 目篩；稱取乳香、沒藥各550 g，粉碎成細粉后過24 目篩，在35 MPa、45 ℃下超臨界CO2萃取3 h，提取物收率為6%～7%。將上述藥材粉末混合過篩，即得）。

1.2 儀器 Agilent 7000 GC?MS 聯(lián)用儀（美國Agi?lent Technologies 公 司）；GENIUS 3 渦旋混合器（德國IKA 公司）；Milli?Q 純水儀（美國Millipore公司）；DL?360 超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）；Minispin 離心機（德國Eppendorf 公司）；JA31002 電子天平（上海精天電子儀器有限公司）；H550S 顯微鏡（日本Nikon 公司）。

1.3 動物 SPF 級健康雌性SD 大鼠18 只，6 周齡，體質量140～160 g，由上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號SCXK（滬）2013?0016。大鼠在溫度20～22 ℃、相對濕度45%～65%，光照／黑暗12 h／12 h 條件下飼養(yǎng)，自由進食飲水，適應性飼養(yǎng)1 周后開始實驗。

2 方法與結果

2.1 造模、分組及給藥 參考文獻［3］報道。實驗第1 天，大鼠灌胃給予溶有二甲基苯蒽（DMBA）的芝麻油（0.1 g／kg），從造模第2 周開始以5 d 為1 個周期，灌胃給予雌激素、孕激素［第1～3 天戊酸雌二醇片（14.1 mg／kg），第4 天醋酸甲羥孕酮片（19.8 mg／kg），第5 天停止給藥］至第9 周造模結束。大鼠隨機分為西黃方正常組、西黃方模型組，均灌胃給予相應活性組分［891.8 mg／kg 乳香及沒藥提取物、122 mg／kg 牛黃、122 mg／kg 麝香（含2.73 mg／kg 麝香酮）］。

2.2 指標檢測

2.2.1 體征 西黃方正常組大鼠毛色光澤，精神狀態(tài)較佳；西黃方模型組大鼠在造模后期飲食量下降，糞便小而少，毛色沉暗、發(fā)黃，尾呈棕黃色并有鱗片出現(xiàn)，乳頭有增大趨勢。

2.2.2 體質量 圖1 顯示，西黃方正常組大鼠體質量穩(wěn)定增長；西黃方模型組大鼠在造模6 周后體質量增長緩慢，從第7 周至造模結束后低于西黃方正常組（P＜0.05）。

圖1 大鼠體質量變化曲線Fig.1 Changing curves for rat body weights

2.2.3 乳頭直徑 一般大鼠胸腹部第3～5 對乳房的發(fā)育比較完全［4］，容易暴露，故本實驗觀察該處乳頭直徑的變化。圖2 顯示，造模前后西黃方正常組大鼠乳頭直徑無明顯變化（P＞0.05），而造模后西黃方模型組大鼠第3 對右側、第5 對雙側乳頭直徑增大（P＜0.05）。

2.2.4 乳腺組織形態(tài) 造模結束后隨機取出各組大鼠第3、5 對乳腺組織，置于10%福爾馬林中固定，脫水，石蠟包埋，制片，HE 染色，顯微鏡下觀察其形態(tài)。圖3 顯示，西黃方正常組大鼠乳腺組織未見明顯病理變化；西黃方模型組大鼠乳腺組織增生，腺泡分界模糊，導管上皮細胞增生顯著，輕度異形，但整體結構未見腫瘤的浸潤性擴張，根據(jù)2012 年版WHO 乳腺腫瘤組織學分類標準［5］，可判斷為非典型增生。

圖2 造模前后大鼠乳頭直徑比較Fig.2 Comparison of rat nipple diameters before and after modeling

圖3 大鼠乳腺組織HE 染色（×100）Fig.3 HE staining of rat breast tissues（×100）

2.3 麝香酮含有量測定

2.3.1 GC?MS 條件

2.3.1.1 色譜 Agilent HP?5 毛細管色譜柱（0.32 mm×0.25 μm，30 m）；進樣口溫度260 ℃；程序升溫（初始60 ℃，5 ℃／min 升至160 ℃，10 ℃／min 升 至240 ℃，維持2 min，分析時間30 min）；載氣氦氣，體積流量1 mL／min；不分流進樣，進樣量2 μL。

2.3.1.2 質譜 EI 源（電壓70 eV）；離子源溫度230 ℃；MRM 掃描模式；正十七烷以m／z240 為前級離子，m／z99、71 為產物離子，碰撞能量20 eV；麝香酮以m／z238 為前級離子，m／z85、67 為產物離子，碰撞能量30 eV。

2.3.2 溶液制備

2.3.2.1 對照品溶液 精密稱取麝香酮對照品適量，加乙酸乙酯?二氯甲烷（8 ∶2）混合溶液制成含1.031 4 mg／mL 該成分的溶液，即得。

2.3.2.2 內標溶液 精密稱取正十七烷對照品適量，加乙酸乙酯?二氯甲烷（8 ∶2）混合溶液制成含2.994 μg／mL 該成分的溶液，即得。

2.3.3 血漿樣品處理 精密吸取大鼠血漿300 μL，加入20 μL 內標溶液，振蕩混勻，加入乙酸乙酯?二氯甲烷（8 ∶2）混合溶液500 μL，渦旋5 min后靜置5 min，12 000 r／min 離心10 min，分取有機相，殘余樣品加入500 μL 混合溶液同法萃取，將2 次萃取的有機相富集，常溫下N2吹干，分析前用50 μL 乙酸乙酯復溶，渦旋5 min，12 000 r／min 離心10 min，取40 μL 上清液進樣。

2.3.4 專屬性試驗 取空白血漿加內標、對照品加內標、給藥0.5 h 后血漿樣品溶液，在“2.3.1”項條件下進樣測定，結果見圖4。由此可知，麝香酮、內標（正十七烷）保留時間分別為26.55、24.36 min，血漿中雜質對測定無干擾。

2.3.5 線性關系考察 取對照品溶液適量，乙酸乙酯?二氯甲烷（8 ∶2）混合溶液依次稀釋至322.31、161.16、80.58、40.29、20.14 ng／mL，向300 μL 大鼠空白血漿中加入上述稀釋液及內標溶液各20 μL，按 “2.3.3” 項下方法處理，在“2.3.1” 項條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X），麝香酮、內標（正十七烷）峰面積比值為縱坐標（Y）進行回歸，得方程為Y＝0.219 2X＋0.278 1（r＝0.999 5），在1.34～21.48 ng／mL范圍內線性關系良好。

圖4 麝香酮GC?MS 色譜圖Fig.4 GC?MS chromatograms of muscone

2.3.6 精密度試驗 取對照品溶液適量，加入空白血漿制成1.34、10.74、21.48 ng／mL 質控樣品溶液，每個質量濃度平行5 份，按“2.3.3” 項下方法處理，同一天在“2.3.1” 項條件下進樣測定5 次，測得日 內精密 度 RSD 分別為0.97%、1.56%、2.13%；同法連續(xù)測定3 d，每天1 次，測得日間精密度RSD 分別為5.05%、1.28%、7.36%，表明該方法精密度良好。

2.3.7 準確度試驗 取對照品溶液適量，加入空白血漿制成1.34、10.74、21.48 ng／mL 質控樣品溶液，每個質量濃度平行5 份，按“2.3.3” 項下方法處理，在“2.3.1” 項條件下進樣測定，測得準確度為77.31%～116.51%，表明該方法準確度良好。

2.3.8 提取回收率及基質效應 取對照品溶液適量，空白血漿制成1.34、10.74、21.48 ng／mL質控樣品溶液，每個質量濃度平行5 份，按“2.3.3” 項下方法處理，在“2.3.1” 項條件下進樣測定，得到對照品、內標峰面積比值A1；取大鼠空白血漿300 μL，按“2.3.3” 項下方法處理，上清液中加入對照品、內標溶液，振蕩混勻，常溫下N2吹干，分析前加入50 μL 乙酸乙酯復溶，渦旋5 min，12 000 r／min 離心10 min，取40 μL上清液，在“2.3.1” 項條件下進樣測定，得到對照品、內標峰面積比值A2；取含對照品的甲醇溶液，在“2.3.1” 項條件下進樣測定，得到對照品、內標峰面積比值A3。以A1、A2比值為提取回收率，A2、A3比值為基質效應，測得不同質量濃度對照品溶液的提取回收率為91.76%～103.77%，基質效應均達到80%以上，表明該方法滿足相關分析要求。

2.3.9 穩(wěn)定性試驗 取對照品溶液適量，加入空白血漿制成1.34、10.74、21.48 ng／mL 質控樣品溶液，室溫下放置24 h 后按“2.3.3” 項下方法處理，在“2.3.1” 項條件下進樣測定，測得麝香酮峰面積RSD 小于5%，表明溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.4 藥動學研究 將大鼠隨機分為麝香組、西黃方正常組、西黃方模型組，灌胃給藥30 d，每天1 次，麝香組給予人工麝香（122 mg／kg，含2.73 mg／kg麝香酮），西黃方正常組、西黃方模型組給予相應活性組分［891.8 mg／kg 乳香及沒藥提取物、122 mg／kg牛黃、122 mg／kg 麝香（含2.73 mg／kg 麝香酮）］。第30 天給藥后，于0.083、0.25、0.5、1、1.5、2、4、6、8、24 h 眼眶后靜脈叢取血各約0.5 mL，置于肝素鈉溶液處理過的離心管中，按“2.3.3” 項下方法處理，在“2.3.1” 項條件下進樣測定，計算麝香酮血藥濃度。

通過DAS2.0 軟件中的非房室模型計算主要藥動學參數(shù)，SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，組間比較若方差齊，則采用t檢驗；若方差不齊，則采用秩和檢驗，結果見表1、圖5。由此可知，麝香組在0.8 h 就達到Tmax，隨后迅速分布和消除，4 h后基本 無法測 出；西黃方 正常組 AUC0～t、AUC0～∞、MRT0～t、MRT0～∞、t1／2z高于麝香組（P＜0.05），CLz／F降低（P＜0.05）；與西黃方正常組比較，西黃方模型組AUC0～t、AUC0～∞、MRT0～t升高（P＜0.05），CLz／F降低（P＜0.05）。

3 討論

從藥動學角度開展復方配伍研究，對闡明中醫(yī)藥理論內涵、實現(xiàn)中藥復方現(xiàn)代化具有重要意義。隨著對疾病發(fā)生機制的揭示，關注藥物體內作用過程，比較正常、病理狀態(tài)下機體藥動學差異，是指導臨床合理用藥、相關劑型研發(fā)的基礎。

表1 麝香酮主要藥動學參數(shù)（， n＝6）Tab.1 Main pharmacokinetic parameters for muscone（， n＝6）

表1 麝香酮主要藥動學參數(shù)（， n＝6）Tab.1 Main pharmacokinetic parameters for muscone（， n＝6）

注：與麝香組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與西黃方正常組比較，▲P＜0.05。

圖5 麝香酮血藥濃度?時間曲線Fig.5 Plasma concentration?time curves for muscone

目前，已有關于西黃丸可逆轉大鼠乳腺癌癌前病變的報道，給藥方式為造模后連續(xù)灌胃水提液30 d［6］。在西黃方體內藥動學研究中，若采用單劑量給藥則難以客觀描述該方對機體的影響，而且乳腺癌癌前病變的中醫(yī)藥治療是一個長期過程［7］，故本實驗采用多劑量灌胃給藥，旨在更接近動物真實的機體狀態(tài)。

臨床上許多藥物長期使用時，會產生蓄積現(xiàn)象。本實驗發(fā)現(xiàn)，灌胃給藥30 d 后麝香組、西黃方正常組麝香酮t1／2分別為0.84、4.01 h，表明多劑量給藥難以造成該成分在正常大鼠體內的蓄積；與西黃方正常組比較，西黃方模型組中麝香酮t1／2較高，雖然差異無統(tǒng)計學意義，但在后期相關新劑型設計中仍需加以重視。

結果顯示，大鼠灌胃給予麝香后體內藥動學趨勢與文獻［8?10］報道的麝香酮單體基本一致，均表現(xiàn)為吸收快、消除快。目前，有關麝香在復方中的體內藥動學研究較少，對比現(xiàn)有的麝香保心丸［11］、片仔癀［12］報道發(fā)現(xiàn)，2 種制劑中麝香酮MRT0～t、t1／2、Tmax有所延長，與本實驗結果一致，即復方配伍可影響該成分在大鼠體內的藥動學，使其吸收程度增加，體內清除減慢，生物利用度升高。課題組前期采用大鼠在體單向腸灌流模型，從吸收角度對麝香單味藥及西黃方的腸吸收特征進行了研究，發(fā)現(xiàn)西黃方中麝香酮的吸收在不同腸段有遞增趨勢，其中十二指腸Ka、Papp更顯著［13］，也是該成分最佳吸收腸段［14］；本實驗從藥動學角度出發(fā)，進一步證明了復方配伍的協(xié)同作用。

另外，與西黃方正常組比較，西黃方模型組麝香酮滯留時間延長，清除率降低，AUC0-t約為正常組的170%，表明在DMBA 聯(lián)合雌激素、孕激素制備大鼠乳腺癌癌前病變模型時，可能對藥物本身產生了作用，從而影響其體內過程，具體機制還有待進一步研究。