王秀珍，鄒偉，李冀，蔡國鋒，劉凱，賈坤平，王特哈斯，彭宇飛*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；3.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

近年來，溶栓療法、冠脈搭橋等血管再通技術被廣泛應用于缺血性心肌病導致的急性心肌缺血的治療，隨之而來的心肌缺血再灌注引起的組織進一步損傷一直是臨床研究的熱點問題[1]。心肌缺血再灌注損傷( myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)是指在缺血區(qū)恢復血供后，心肌損傷反而出現(xiàn)進一步加重的病理現(xiàn)象[2]。有研究表明最終梗死面積的半數(shù)以上是再灌注損傷造成的[3]，因此,防治MIRI意義重大。研究表明細胞凋亡、線粒體功能障礙、氧化應激等因素都可引起MIRI[4-7]，故單一治療方法療效欠佳。

中醫(yī)藥傳統(tǒng)治療具有多靶點，多方位，多調(diào)控的作用，穩(wěn)心丹主要由尖葉假龍膽、丹參、當歸三味藥物組成，已有研究證實這三味藥均具有抗心肌缺血、抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗腫瘤等心肌保護作用[8-13]，然三味藥物的組方配伍研究未見國內(nèi)外報道，因此,本實驗旨在探討穩(wěn)心丹組方對MIRI大鼠的心肌保護作用及分子機制，以期為臨床應用提供基礎性實驗研究依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗藥材

尖葉假龍膽采購于內(nèi)蒙古根河市；其余藥物采購于黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院。將尖葉假龍膽、丹參、當歸分別用75%乙醇浸泡，提取濃縮液(濃度1 g/mL)按1∶2∶1的比例配伍，根據(jù)成人-大鼠體表面積折算，按總生藥量6 g/kg灌胃。

1.2 實驗動物

SPF級SD大鼠，購于黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，合格證號：SCXK(黑)2015004。

1.3 主要試劑

CK、LDH試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)；LY294002(Selleck)；二甲基亞砜(美國Sigma公司)；氯化三苯基四氮唑(美國Sigma公司)；兔抗Akt多克隆抗體、兔抗GSK-3β多克隆抗體、兔抗p-Akt多克隆抗體、兔抗p-GSK-3β多克隆抗體(CST)；兔抗多克隆一抗(武漢博士德)。

1.4 主要儀器

Med Lab型多道生物信號分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；Image-pro plus6.0病理圖像分析系統(tǒng)(麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 動物分組

SPF級SD大鼠，雌雄各半，隨機分為4組，每組6只。穩(wěn)心丹組、LY294002組給予提取液灌胃14 d；假手術組、模型組給予生理鹽水灌胃14 d。

2.2 動物模型制備

SPF級SD大鼠術前禁食，不禁水12 h，腹腔麻醉，連接BL-420S生物系統(tǒng)監(jiān)測大鼠心電圖變化，行氣管插管術，給予輔助通氣(通氣頻率約50次/min)，縱行切開胸骨左緣心尖處2～3 cm皮膚，分離肌肉，打開胸腔，暴露心臟。用3/0號無菌帶針縫合線在左心耳下緣2 mm處進針，肺動脈圓錐旁出針，將冠狀動脈左前降支進行結(jié)扎。觀察心臟表面顏色，若出現(xiàn)發(fā)紺后立刻送回胸腔并觀察心電圖變化，II導聯(lián)出現(xiàn)ST段抬高或T波高聳，表明心肌缺血形成；30 min后松開止血鉗，恢復再灌注60 min，再灌注損傷成功標志以II導聯(lián)上抬的ST段下降50%或高聳的T波下降為準。假手術組只穿線不結(jié)扎；LY294002組于再灌注前10 min注射LY294002(濃度0.3 mg/kg)。

2.3 心肌損傷標志物檢測

各組大鼠恢復再灌注60 min后，收集分離血清，按試劑盒要求，用酶聯(lián)免疫法檢測血清中CK、LDH含量。

2.4 心肌梗死面積

在心臟結(jié)扎線下，將心臟切成厚度約為1～2 mm的薄心肌片，將心肌片置于1%TTC溶液中，剪取蒼白色的梗死心肌稱重，計算梗死面積百分比(梗死面積/全心重×100%)。

2.5 細胞凋亡指數(shù)

各組大鼠恢復再灌注60 min后，迅速取出心臟，取約2 mm×2 mm×2 mm心肌組織，4%多聚甲醛固定，組織包埋，切片機切片。TUNEL染色，顯微鏡下觀察視野內(nèi)陽性細胞并計算細胞凋亡指數(shù)(陽性細胞/心肌細胞總數(shù)×100%)。

2.6 Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β(Ser9)蛋白含量檢測

采用Western blot法，在心肌組織蛋白抽提后經(jīng)RIPA裂解緩沖液將心肌組織細胞裂解；待樣品冷卻到室溫后，SDS-PAGE蛋白電泳分離，轉(zhuǎn)膜，蛋白印記，ECL顯色等。GAPDH作為內(nèi)參，采用Bio-Rad軟件進行圖片分析。

2.7 統(tǒng)計學分析

3 結(jié)果

3.1 穩(wěn)心丹對MIRI大鼠血清中心肌酶含量的影響

與假手術組比較，模型組CK、LDH含量顯著增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組比較，穩(wěn)心丹組及LY29002組均能降低CK、LDH表達，具有顯著性差異(P<0.01)，穩(wěn)心丹組與LY29002組比較，具有顯著性差異(P<0.01)。提示穩(wěn)心丹能夠明顯降低大鼠血清中心肌酶含量。見表1，圖1。

表1 各組對MIRI大鼠血清CK、LDH含量的影響

注：與假手術組比較，#P<0.01;與模型組比較，*P<0.01;與穩(wěn)心丹組比較，▲P<0.01。圖1 各組對MIRI大鼠血清CK、LDH含量的影響

3.2 穩(wěn)心丹對MIRI大鼠心肌梗死面積的影響

模型組梗死面積較之于假手術組明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，穩(wěn)心丹組、LY294002組梗死面積顯著降低(P<0.01)；與LY294002組比較，穩(wěn)心丹組梗死面積顯著降低(P<0.01)。提示穩(wěn)心丹組能夠明顯減少大鼠心肌梗死面積，LY294002組能夠阻滯穩(wěn)心丹對心肌的保護作用。見表2，圖2。

表2 各組對MIRI大鼠心肌梗死面積的影響

注：與假手術組比較，#P<0.05;與模型組比較，*P<0.01;與穩(wěn)心丹組比較,▲P<0.01。圖2 各組對MIRI大鼠心肌梗死面積的影響

3.3 穩(wěn)心丹對MIRI大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)的影響

與假手術組比較，模型組細胞凋亡指數(shù)顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，穩(wěn)心丹凋亡指數(shù)顯著降低(P<0.01)，LY294002組無顯著性變化(P>0.05)；與穩(wěn)心丹組比較，LY294002組細胞凋亡指數(shù)顯著增高(P<0.01)。提示穩(wěn)心丹組能夠降低細胞凋亡指數(shù)，但是LY294002組則阻滯了穩(wěn)心丹組的作用。見表3，圖3，圖4。

表3 各組對大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)的影響

注：與假手術比較，#P<0.01；與模型組比較，*P<001；與穩(wěn)心丹組比較，▲P<0.01。圖3 各組對大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)的影響

注:A組：假手術組;B組：模型組;C組：穩(wěn)心丹組;D組：LY294002組。圖4 各組對大鼠心肌細胞凋亡的影響

3.4 穩(wěn)心丹對 MIRI大鼠心肌組織中Akt、p-Akt蛋白含量的影響

與假手術組比較，模型組p-Akt蛋白水平顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，穩(wěn)心丹組p-Akt蛋白水平明顯升高(P<0.01)，LY294002組與之比較無明顯差異(P>0.05)；與穩(wěn)心丹組比較，LY294002組p-Akt蛋白水平明顯降低(P<0.01)。提示LY294002組抑制了Akt的磷酸化。見圖5,表4，圖6。

圖5 各組心肌組織Akt蛋白、p-Akt蛋白表達

表4 各組心肌組織p-Akt/GAPDH比值變化

注：與假手術組比較，#P<0.01;與模型組比較，*P<0.01;與穩(wěn)心丹組比較，▲P<0.01。圖6 各組心肌組織p-Akt/GAPDH比值變化

3.5 各組對MIRI大鼠心肌組織中GSK-3β、p-GSK-3β(Ser9)蛋白含量的影響

與假手術組比較，模型組中p-GSK-3β(Ser9)水平顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，穩(wěn)心丹組明顯升高了p-GSK-3β(Ser9)(P<0.01)，LY294002組與之比較無明顯差異(P>0.05)；與穩(wěn)心丹組比較，LY294002組p-GSK-3β(Ser9)水平顯著降低(P<0.01)。提示LY294002通過抑制Akt的活化，進一步抑制了GSK-3β(Ser9)的活化。見圖7，表5，圖8。

圖7 各組心肌組織GSK-3β蛋白、p-GSK-3β蛋白表達

表5 各組心肌組織p-GSK-3β/GAPDH比值變化

注：與假手術組比較，#P<0.01；與模型組比較，*P<0.01；與穩(wěn)心丹組比較，▲P<0.01。圖8 各組心肌組織p-GSK-3β/GAPDH比值變化

4 討論

心肌缺血再灌注損傷歸屬于中醫(yī)“胸痹心痛病”范疇。臨床傳統(tǒng)中醫(yī)藥對本病的治療多從血瘀、痰濁與氣虛等展開治療[8]，然“熱化”這一病機一直未得到現(xiàn)代醫(yī)療工作者的重視。早在《內(nèi)經(jīng)》中就有“熱”與心痛的相關論述，《素問》曰“心熱病者……熱爭則卒心痛”“火熱受邪，心病生焉”，后世《周慎齋遺書》等著作均有發(fā)微。臨床研究證實胸痹心痛病熱化證比例約為42.18%[9]，胡鏡清等總結(jié)諸多國醫(yī)大師學術經(jīng)驗，認為“瘀熱互結(jié)證”是熱化病機的四種主要類型之一[10]。穩(wěn)心丹由尖葉假龍膽、丹參、當歸組成。尖葉假龍膽在藏族、蒙古族等藥物中有所應用，民間稱作“穩(wěn)心草”，蒙藥名為阿古特-其其格，鄂侖春族獵民常用本品代茶飲治療心血管疾病療效顯著。本品具有味苦，性涼，苦以通泄，涼以瀉火，善治心中邪熱所致心悸、心痛?？锖W等[11]研究表明尖葉假龍膽有效部位可明顯推遲實驗小鼠心律失常出現(xiàn)的時間及縮短心律失常持續(xù)時間。李冀等[12]實驗研究證實尖葉假龍膽醇提液能夠明顯升高MIRI大鼠血清中6-酮-PGF1α的含量，降低TXB2的含量。丹參味苦、性微寒，入心、肝經(jīng)，活血化瘀，止心痛。王明樂[13]提出丹參提取物能夠明顯降低大鼠心肌酶含量，降低氧化應激因子表達。當歸味甘，性辛溫，入心、肝、脾經(jīng)，補血活血，止痛。上官海娟等[14]研究表明當歸可抑制細胞凋亡因子(Bax/Bcl-2)的表達，發(fā)揮心肌保護作用。陳彥文等[15]研究證實大劑量當歸水煎液能夠明顯減少大鼠心肌梗死面積，抑制心肌細胞凋亡。以上三味藥物在實驗研究中均證實對心肌具有保護作用，但是組方配伍研究未見國內(nèi)外報道，故本課題基于瘀熱互結(jié)之胸痹心痛病之病機，確立“清熱活血化瘀”治則，尖葉假龍膽清心瀉火而除煩；丹參活血化瘀，止心痛；尖葉假龍膽、丹參性味較為苦寒，配伍當歸佐制兩者的苦寒之性。如此三者配伍，涼血化瘀止痛。

本課題研究結(jié)果顯示MIRI發(fā)生后血清中CK、LDH含量明顯升高，心肌梗死面積增大；穩(wěn)心丹能夠降低血清中CK、LDH含量，減少心肌梗死面積，而LY294002組則阻斷了穩(wěn)心丹的這一心肌保護作用。

PI3K/Akt是介導細胞信號傳導的重要信號通路，在細胞因子及激素等胞外信號作用下可激活下游激酶Akt，Akt是該信號通路的核心環(huán)節(jié)，有研究結(jié)果顯示加入Akt特異性阻滯劑抑制Akt的活性時心肌細胞的收縮功能明顯下降[16]。Akt激活后可作用于下游的糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)等靶點，GSK-3β主要具有促進細胞增長，維持細胞骨架的作用，GSK-3β的活性及磷酸化程度與細胞凋亡有著密切關系[17]，GSK-3β的失活會導致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)開放，細胞凋亡發(fā)生。GSK-3β有兩個磷酸化位點：酪氨酸216(Tyr216)及絲氨酸9(Ser9)，Tyr216位點磷酸化能夠增加GSK-3β的活性，而Ser9位點的磷酸化則降低GSK-3β的活性。活化的Akt磷酸化Ser9使GSK-3β被磷酸化，致使活性被抑制，導致其對下游因子的調(diào)控能力喪失，最終導致mPTP的開放，細胞凋亡的發(fā)生[18]。研究證實活化的Akt能夠使GSK-3β磷酸化，抑制mPTP開放，抑制凋亡因子細胞色素c釋放，減少線粒體損傷，發(fā)揮心肌保護作用[19]。有研究證實LY294002它能夠特異性阻止PI3K下游底物的產(chǎn)生，導致PI3K/Akt信號通路失活[20]。

本課題進一步研究結(jié)果表明穩(wěn)心丹能夠明顯降低大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)；上調(diào)p-Akt及其下游蛋白p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達，在加入PI3K特異性阻滯劑LY294002后，細胞凋亡指數(shù)明顯上升，p-Akt及p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達明顯降低，由此提示穩(wěn)心丹抗MIRI的作用可能與激活PI3K/Akt/GSK-3β信號通路有關。

綜上所述，本課題證實穩(wěn)心丹能夠通過激活PI3K/Akt/GSK-3β信號通路，抑制細胞凋亡，發(fā)揮心肌保護作用。本課題將為道地藥材的推廣提供實驗研究基礎，我們后續(xù)將對穩(wěn)心丹調(diào)控心肌細胞線粒體凋亡的機制進行進一步探討。