王勝優(yōu)，艾仁麗，孫海峰，譚艾娟

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省煙草科學(xué)研究所，貴州 貴陽 550003)

Rubisco，全稱為1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶，主要存在于葉綠體中，是植物光合作用過程中固定CO2的關(guān)鍵酶[1]。1947年WILDMEN和BONNOR首次發(fā)現(xiàn)了Rubisco，直到1965年人們才第1次從菠菜中純化得到了這個(gè)酶[2]。它存在于所有能進(jìn)行光合作用的生物體內(nèi)，包括C3,C4植物及藻類等，根據(jù)Rubisco大小亞基的組成方式及來源不同，可分為4類(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ型)[3]。Ⅰ型 Rubisco最為常見，由8個(gè)相對分子質(zhì)量為50～55 kD的大亞基和8個(gè)相對分子質(zhì)量為12～18 kD的小亞基組成的十六聚體，相互結(jié)合形成雙層結(jié)構(gòu)，每一層都含有4個(gè)大亞基和4個(gè)小亞基，蛋白完整相對分子質(zhì)量為520～550 kD[4-5]，存在于所有的真核生物、藍(lán)細(xì)菌、化能自養(yǎng)及光養(yǎng)的自變菌中。Rubisco占煙草可溶性蛋白的45%～50%。Rubisco含有全部氨基酸，且有的必需氨基酸含量遠(yuǎn)超F(xiàn)AO/WHO標(biāo)準(zhǔn)。含硒Rubisco抗氧化性極強(qiáng)，高純度的煙草含硒Rubisco可以作為保健藥品開發(fā)利用。煙草硒蛋白已經(jīng)被中國衛(wèi)健委批準(zhǔn)作為醫(yī)藥保健品的添加劑，開發(fā)利用煙草蛋白，以此為煙草行業(yè)去庫存，穩(wěn)種植，增加煙農(nóng)收入，進(jìn)而對促進(jìn)中國煙草行業(yè)可持續(xù)發(fā)展和產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整均具有重要意義[6-7]。目前，對于Rubisco的提取研究較少，都是以堿溶酸沉法或等電點(diǎn)沉淀法為主，但因?yàn)闊煵菘扇苄缘鞍追N類較多，即使是等電點(diǎn)沉淀法獲得的粗蛋白中均含有大量的雜蛋白，導(dǎo)致純化工藝煩瑣、成本過高等，難以工業(yè)化應(yīng)用。關(guān)于Rubisco的理化性質(zhì)研究比較多，但是也僅涉及等電點(diǎn)、溶解性等。關(guān)于Rubisco 生物信息學(xué)分析少為報(bào)道。因此，通過分析煙草Rubisco的生物信息學(xué)特性而針對性的設(shè)計(jì)提取純化方法變得尤為重要。本研究根據(jù)Rubisco具有耐熱性使用熱沉法提取Rubisco，應(yīng)用生物信息學(xué)的方法對煙草Rubisco的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)等進(jìn)行預(yù)測和分析，以期為煙葉Rubisco的多用途開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 云煙87(旺長期煙葉，2019年貴州產(chǎn)，由貴州省煙草科學(xué)研究所提供，洗凈后瀝干多余的水分，儲存于-80 ℃超低溫冰箱中，蛋白含量3.75%)。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris 、TEMED(索萊寶生物科技有限公司)，均為分析純；低相對分子質(zhì)量蛋白Marker、超高相對分子質(zhì)量蛋白Marker (購自上海源葉生物科技有限公司)

1.1.3 主要儀器 湖南平凡湘儀離心機(jī)，湖南湘儀試驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司；721N可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；定時(shí)恒溫磁力攪拌器，上海滬西分析儀器廠有限公司；Thermo Scienti Rubiscoc波長酶標(biāo)儀，賽默飛世爾(上海)儀器有限公司；試驗(yàn)型冷凍干燥機(jī)，上海皓莊有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Rubisco 的粗提取(0～ 4 ℃)、分離 新鮮煙草→加入堿液勻漿、浸提→濾布過濾→硅藻土脫色除雜→熱沉→離心→粗蛋白。

稱取100 g云煙87葉片，加入預(yù)冷的10倍液料比蛋白提取液 (0.05 mol·L-1磷酸緩沖液pH 8.0，1% PVP，0.01 mol·L-1亞硫酸鈉)，勻漿后靜置勻漿液40 min。硅藻土抽濾除雜后將濾液置于恒溫水浴鍋中50 ℃保溫20 min，冰浴降至室溫后，以3 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心20 min，沉淀即為Rubisco粗蛋白。粗蛋白沉淀用2 mol·L-1氯化鈉溶解后，通過凝膠層析柱進(jìn)行純化，收集合并蛋白質(zhì)組分1，冷凍干燥濃縮，儲存于-80 ℃冰箱。

1.2.2 SDS-PAGE電泳 參考文獻(xiàn)[8-9]的方法，配制15%分離膠、5%濃縮膠，設(shè)置電壓為120 V，穩(wěn)壓待溴酚藍(lán)遷移至離凝膠底部2 cm 的位置時(shí)停止電泳，染色30 min。脫色直到蛋白條帶清晰，以背景脫為無色為終止。通過制作Marker的遷移率標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定計(jì)算蛋白相對分子質(zhì)量。

1.2.3 Rubisco蛋白質(zhì)譜鑒定分析 SDS-PAGE切膠回收，蛋白質(zhì)的還原烷基化如下：加入終濃度10 mmol·L-1二硫蘇糖醇(DTT)還原蛋白質(zhì)，接著加入終濃度55 mmol·L-1碘乙酰胺(IAM)，最后加入1 μg的Trypsin酶，過夜酶解8～16 h。酶解產(chǎn)生的多肽用C 18柱層析除鹽，已經(jīng)除鹽的多肽抽干后用15 μL Loading Buffer (0.1%甲酸，3%乙腈)溶解多肽。多肽上LC-MS/MS(ekspertTMnanoLC；AB Sciex TripleTOF 5600-plus) 儀器進(jìn)行分析，上機(jī)條件參考王土連法[10]。LC-MS/MS下機(jī)后，將原始下機(jī)數(shù)據(jù)直接提交到與AB SCIEX Triple TOFTM5600 plus質(zhì)譜儀連接的Proteinpilot 軟件中進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索。通過NCBI數(shù)據(jù)庫中Blast比對，再次驗(yàn)證是否獲得正確的目的蛋白。

通過ProtParam軟件對Rubisco的氨基酸組分進(jìn)行分析，通過ProtParam 軟件對Rubisco進(jìn)行不穩(wěn)定系數(shù)分析，通過Prot Scale對Rubisco的疏水性特征進(jìn)行預(yù)測分析，通過Signal P 5.0 Sever在線分析軟件進(jìn)行信號肽預(yù)測，通過TMHMM Server對蛋白的跨膜區(qū)域進(jìn)行預(yù)測，通過SOPMA對蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，通過 SWISS-MODEL對Rubisco的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草SDS-PAGE電泳

將經(jīng)過Sephadex G-200純化后收集組分1進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖1所示。每個(gè)樣品點(diǎn)樣2次，孔1，2為購買所得標(biāo)準(zhǔn)品(純度>95%)，3，4孔為組分1。由圖1可見，組分1的大小亞基相對分子質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)品相符，通過遷移率標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到，組分1的大小亞基相對分子質(zhì)量分別為55,13.6 kD，其相對分子質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)品接近，推測該組分為Rubisco。圖1中樣品相對標(biāo)準(zhǔn)品而言的雜帶較少且顏色較淺，說明試驗(yàn)純化所得Rubisco純度高于標(biāo)準(zhǔn)品純度的95%[11-12]。

2.2 煙草Rubisco生物信息學(xué)分析

2.2.1 煙草Rubisco氨基酸序列比對 對測序獲得樣品氨基酸序列和NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對，純化后得到的樣品大亞基氨基酸亞基序列與數(shù)據(jù)庫中煙草的二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)長鏈氨基酸序列相似度最高為100%；其次，是顛茄中的二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)長鏈氨基酸序列相似度為99.79%；純化后得到的小亞基氨基酸序列與假想蛋白(芽孢桿菌FJAT-21351)基因序列相似度最高，為100%，其次，馬鈴薯中的二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)小鏈氨基酸序列相似性為95.00%。煙草中的二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)小鏈氨基酸序列相似性為93.68%，小亞基氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫對比發(fā)現(xiàn)有11個(gè)氨基酸缺失或改變。這些序列的不同可能是煙葉品種、煙葉生長環(huán)境等造成的差異而導(dǎo)致堿基的突變，使翻譯表達(dá)的氨基酸不同[13-14]。經(jīng)過相似度對比，可確定純化所得即為Rubisco。樣品大小亞基與煙草Rubisco(Rubisco)亞基氨基酸序列比對如圖2所示。

注：M.低相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker；1，2.Rubisco標(biāo)準(zhǔn)品(來源于菠菜，純度>95%)；3，4.Sephadex G-200純化的樣品。Note：M.Low molecular weight protein Marker;1,2.Rubisco standard product (from Spinach,purity>95%);3,4.Sephadex G-200 purified sample.圖1 樣品SDS-PAGE電泳圖譜Fig.1 Sample SDS-PAGE electropherogram

圖2 RbcL和RbcS氨基酸序列Blast比對結(jié)果Fig.2 RbcL and RbcS amino acid sequence blast alignment results

2.2.2 煙草Rubisco氨基酸組成分析 通過ProtParam軟件對煙草Rubisco的氨基酸組分進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3。煙草Rubisco含有20 種氨基酸，且8種必需氨基酸的含量都遠(yuǎn)超聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)標(biāo)準(zhǔn)，谷氨酸的組成高達(dá)7.7%，其金屬螯合及質(zhì)子供體能力有利于增強(qiáng)抗氧化活性。KONG等[15]認(rèn)為，甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸的側(cè)鏈基團(tuán)、結(jié)構(gòu)等有利于自由基的結(jié)合，從而提高抗氧化活性，煙草Rubisco中僅這3種氨基酸組成占比就高達(dá)24.5%。脯氨酸、谷氨酸作為維持蛋白熱穩(wěn)定性的重要蛋白，兩種氨基酸含量高達(dá)12.7%。因此，分析認(rèn)為煙草Rubisco具有較高抗氧化活性。

注：*為必需氨基酸。Note:* is an essential amino acid.圖3 Rubisco的氨基酸組成Fig.3 Amino acid composition of Rubisco protein

2.2.3 煙草Rubisco不穩(wěn)定系數(shù)分析 通過 ProtParam 軟件對煙草Rubisco的大小亞基進(jìn)行不穩(wěn)定系數(shù)分析，結(jié)果如圖4所示。大亞基的不穩(wěn)定系數(shù)為38.1，小亞基的不穩(wěn)定系數(shù)為36.75，一般都認(rèn)為低于40屬于穩(wěn)定性較好，且蛋白的結(jié)構(gòu)與功能是相互適應(yīng)的，較穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)表明蛋白具有較高的耐熱性，較穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)為提取高活性蛋白奠定基礎(chǔ)。

圖4 Rubisco大亞基和小亞基的不穩(wěn)定系數(shù)Fig.4 Instability coefficients of Rubisco large and small subunits

2.2.4 煙草Rubisco的親疏水性預(yù)測與分析 通過 Prot Scale預(yù)測工具對煙草Rubisco的疏水性特征進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果如圖5所示。大于0為疏水性，反之亦然。比較代表疏水峰面積和親水峰面積的氨基酸所占的百分率，若疏水峰值大于 0 的氨基酸超過氨基酸組成的一半，可以認(rèn)為由氨基酸合成的整個(gè)蛋白質(zhì)更可能表現(xiàn)出疏水性，反之為親水性[16]。預(yù)測結(jié)果顯示，Rubisco的親水峰面積均大于疏水峰，均為親水性，Rubisco更可能偏為親水性。這一結(jié)果與丁彥蕊等[17]對各家族中高低溫3種類別蛋白的氨基酸變化規(guī)律進(jìn)行試驗(yàn)得出的結(jié)論相背。他們認(rèn)為，高溫蛋白中疏水性氨基酸的含量要顯著高于普通蛋白。這可能與耐高溫蛋白同時(shí)具有抗氧化特性相關(guān)，一般抗氧化蛋白的N端多為疏水性氨基酸，而C端多為親水性氨基酸。這次預(yù)測的各亞基的N端都是疏水性氨基酸(甲硫氨酸)，靠近C端都是親水性氨基酸(大亞基為賴氨酸、小亞基為酪氨酸)。所以Rubisco受抗氧化和耐高溫特性雙重影響，蛋白更偏向于親水性。

圖5 Rubisco親疏水性預(yù)測Fig.5 Rubisco hydrophilicity prediction

2.2.5 煙草Rubisco的信號肽預(yù)測與分析 通過Signal P 5.0 Sever在線分析軟件，分析Rubisco是否具有信號肽，如圖6和圖7所示。蛋白質(zhì)可以具有Sec信號肽(Sec/SPⅠ)，脂蛋白信號肽(Sec/SPⅡ)，Tat信號肽(Tat/SPⅠ)或根本沒有信號肽(其他)。預(yù)測結(jié)果顯示，大亞基具有SP(Sec/SPⅠ)/LIPO(Sec/SPⅡ)/TAT(Tat/SPⅠ)信號肽的可能性為0.0037，小亞基具有SP(Sec/SPⅠ)/LIPO(Sec/SPⅡ)/TAT(Tat/SPⅠ)信號肽的可能性為0.001 4，因此,Rubisco不具有信號肽序列，不含有信號肽的蛋白,分泌到胞外的可能性很低。如果要分泌到胞外就需要額外添加信號肽。

圖6 Rubisco大亞基信號肽預(yù)測Fig.6 Rubisco large subunit signal peptide prediction

圖7 Rubisco小亞基信號肽預(yù)測Fig.7 Rubisco small subunit signal peptide prediction

2.2.6 煙草Rubisco的跨膜區(qū)預(yù)測與分析 通過 TMHMM Server 對蛋白的跨膜區(qū)域進(jìn)行預(yù)測，由圖8和圖9可知，Rubisco不存在跨膜區(qū)域。說明蛋白質(zhì)合成后就于合成處發(fā)揮作用，不存在運(yùn)輸，因此，不可能是分泌蛋白或膜蛋白。還有一種可能，是帶有信號肽的前體蛋白到了運(yùn)輸部位跨膜之后，信號肽被切除了，則煙草Rubisco只可能是定位在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)或細(xì)胞器基質(zhì)中的蛋白。煙草Rubisco是光合作用中固定二氧化碳的關(guān)鍵酶，說明Rubisco應(yīng)該是存在于葉綠體基質(zhì)中。煙草Rubisco大亞基是由核基因編碼，小亞基為葉綠體基因編碼，二者在細(xì)胞質(zhì)中組裝成全酶，經(jīng)跨膜運(yùn)輸?shù)饺~綠體內(nèi)參與卡爾文循環(huán)。對蛋白跨膜區(qū)域的預(yù)測可為提取工藝的選定以及異源表達(dá)獲取蛋白提供一定的依據(jù)[18]。

圖8 Rubisco大亞基跨膜區(qū)域預(yù)測Fig.8 Rubisco large subunit transmembrane region prediction

圖9 Rubisco小亞基跨膜區(qū)域預(yù)測Fig.9 Prediction of Rubisco small subunit transmembrane region

2.2.7 煙草Rubisco的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析 通過 SOPMA 對蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如圖10所示。大亞基參與構(gòu)成β轉(zhuǎn)角的氨基酸為105.45%，小亞基為2.78%，小亞基的無規(guī)則卷曲為48.89%，大亞基為35.64%，小亞基的α-螺旋占比為44.23%，比大亞基含有的α-螺旋占比28.33%要多。此外，螺旋結(jié)構(gòu)集中靠近肽鏈的N末端或者C末端，這樣有利于提高蛋白的耐熱性。α-螺旋形成大量的偶極子，偶極子通過與N末端的帶負(fù)電的殘基或C末端帶正電的殘基相互作用來提高蛋白的穩(wěn)定性[19]。

圖10 Rubisco大亞基和小亞基二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.10 Prediction of the secondary structure of Rubisco large and small subunits

2.2.8 煙草Rubisco的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析 通過 SWISS-MODEL對Rubisco的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如圖11所示。在預(yù)測結(jié)構(gòu)中Rubisco是由大小亞基各8個(gè)組成的超高相對分子質(zhì)量十六聚體，其三級結(jié)構(gòu)形成需要8個(gè)帽子結(jié)構(gòu)、8個(gè)Mg2+作為配體，每個(gè)帽子結(jié)構(gòu)與22個(gè)殘基連接，連接16～17個(gè)褶皺的交互作用。每個(gè)Mg2+與6～7個(gè)殘基連接，參與連接2個(gè)褶皺的交互作用。預(yù)測顯示每個(gè)FI蛋白需要8個(gè)Mg2+作為配體連接殘基。若蛋白需要在體外活化，則需要考慮Mg2+的添加。

圖11 Rubisco 3D 結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.11 Rubisco 3D structure prediction

3 結(jié)論與討論

熱沉法得到的組分1通過SDS-PAGE及蛋白質(zhì)譜測序可證實(shí)其確為Rubisco。Rubisco含有人體所需的全部8種必需氨基酸和10種非必需氨基酸，屬于優(yōu)質(zhì)蛋白。但是，在對蛋白的氨基酸組成分析中發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)的某些氨基酸的含量低于KUNG等[20]的研究結(jié)果，而有些氨基酸含量高于后者，與郭培國等[21]的方法得到的氨基酸含量也有差異。推測可能是因?yàn)镵UNG等用于測定氨基酸含量的是蛋白晶體純度較高，且煙葉品種、煙葉生長環(huán)境等也會導(dǎo)致差異的產(chǎn)生，甚至是基因序列的改變，所以表達(dá)的氨基酸也會存在差異。從營養(yǎng)的角度來看，蛋白的營養(yǎng)價(jià)值取決于氨基酸的組成及比例，尤其是必需氨基酸的組成及比例。聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)的蛋白評分模式指出，必需氨基酸(EAA)/總氨基酸(AA)的比值在40%左右為優(yōu)質(zhì)蛋白，而Rubisco的評分為40.7%，已經(jīng)達(dá)到該標(biāo)準(zhǔn)。

Rubisco穩(wěn)定性高且為親水性蛋白，不存在信號肽及跨膜區(qū)域，說明可考慮使用異源表達(dá)的方式獲取蛋白，但是需要額外添加信號肽序列。余方偉等[22]和薛楠等[23]認(rèn)為α-螺旋是二級結(jié)構(gòu)中最為穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)有利于蛋白耐熱性的提高，而Rubisco的大小亞基中該結(jié)構(gòu)的占比都是最多的，尤其是小亞基甚至達(dá)到44.23%，所以通過對蛋白質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行分析，推測Rubisco應(yīng)該具有較高的耐熱性，且具有一定的抗氧化活性，這兩種性質(zhì)并未疊加，而是相互影響直至達(dá)到一種平衡狀態(tài)，從而使得Rubisco具有獨(dú)特性。因此，在蛋白提取試驗(yàn)中可針對蛋白的耐熱性選擇熱沉法沉淀提取蛋白，可有效降低雜蛋白的干擾。對蛋白的疏水性分析結(jié)果顯示，Rubisco偏親水性且具有抗氧化蛋白的顯著特性，二級結(jié)構(gòu)預(yù)測也顯示出蛋白具有較高的耐熱性。蛋白中的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖與Manajit Hayer-Hartl的大亞基結(jié)構(gòu)一致性為100%，小亞基為89.80%，說明建模預(yù)測具有較高可靠性，其小亞基存在的差異可能是種屬來源及建模數(shù)據(jù)庫不同造成的。