董 琪，張后才，劉飛翔，劉開放，吳文睿，方頌平

（亳州學院生物與食品工程系，安徽亳州 236800）

葛根為豆科多年生落葉藤本植物的干燥根莖，屬于衛(wèi)生部公布多年生豆科藤本藥食兩用植物，其含有豐富的淀粉、膳食纖維、氨基酸，以及對人體有益的微量元素，葛根素、大豆苷、蘆丁等異黃酮類物質，具有極高的營養(yǎng)和藥用價值，素有“南葛北參”和“南方人參”之美譽。葛根黃酮類化合物具有治療心腦血管疾病、預防動脈硬化、抗癌、抗炎癥、舒張平滑肌等多種藥理作用，更值得關注的是，作為其中有效功能性成分之一的葛根素具有解酒護肝的功效[1-3]。

葛根作為提取淀粉或者黃酮的原料，沒有得到充分利用。而以葛根為原料制作發(fā)酵型保健酒時，其豐富的淀粉可為酒的轉化提供物質基礎，異黃酮類則可為“保健”提供物質基礎。葛根酒是以鮮葛根或者葛根粉為原料,經酶解糖化和酵母發(fā)酵或者直接由酒精浸提得到的一種低度酒，因其含有多種功能成分、營養(yǎng)全面、口感帶有濃郁的葛根清香，成為深受大家喜歡的保健酒之一。由于葛根酒是一種新興的保健酒，生產技術和生產工藝還存在釀造工藝繁瑣、成品酒中的葛根素含量低、原酒苦澀味如何去除、葛根酒專門酵母的選擇等問題[4]。濃醪發(fā)酵技術具有提高乙醇濃度、設備利用率高和降低能耗等優(yōu)勢，在釀酒領域得到較多的成功應用[5-6]。因此，采用濃醪發(fā)酵技術提高發(fā)酵型葛根酒的酒精度，較高的酒精度可增加醇溶性的葛根異黃酮含量[7]，并且較高的酒精度可抑制雜菌生長以防生酸，從而可通過后期陳釀改善口感風味。濃醪發(fā)酵葛根酒的開發(fā)可為營養(yǎng)保健酒的開發(fā)提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

菌種：耐高溫釀酒高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司；食品級耐高溫α-淀粉酶150000 U/g、食品級糖化酶260000 U/g，滄州夏盛酶生物技術有限公司；葛根素標準品，中國食品藥品檢定研究院；硫酸、氫氧化鈉、酚酞、磷酸氫二鉀等均購于國藥；野生葛根粉、種植葛根粉購于亳州市中藥材交易市場；野生葛根淀粉，購于國森源葛粉實業(yè)有限公司。

儀器設備：UV-9000S 紫外分光光度計，上海元析；HH.S21-8-S 恒溫水浴鍋，上海躍進；SPX-400-III 生化培養(yǎng)箱,上海躍進；ME204E 電子分析天平，梅特勒；H2500R-2 高速冷凍離心機，湘儀；立式高壓蒸汽滅菌鍋,上海博訊；PE28-pH 計，梅特勒；GZX-9240MBE 電熱鼓風干燥箱，上海博訊；K9860全自動凱氏定氮儀，海能。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝操作要點

1.2.1.1 液化

根據(jù)實驗所需，準確稱取粉碎過篩后的原料，并根據(jù)料液比，將所需自來水加入錐形瓶中，緩緩加入稱量好的原料，邊加入邊攪拌，以防結團；再分別加入KH2PO40.125 g/L；用硫酸將pH 值調節(jié)至5.5，按30 U/g 原料，向瓶中加入耐高溫α-淀粉酶，放入沸水浴中進行液化，每隔一定時間搖勻1 次，90 min后經碘試無藍色，便取出。

1.2.1.2 糖化

將液化后的醪液冷卻至60 ℃，調節(jié)pH4.5，按260 U/g 原料，加入糖化酶，混勻后，于60 ℃水浴鍋中保溫一定時間。

1.2.1.3 發(fā)酵

將糖化后的醪液冷卻至30 ℃以下，按原料的0.5 ‰，加入活性干酵母，然后放于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，直至無氣泡產生。

1.2.1.4 酒液的制備

發(fā)酵結束后，使用冷凍離心機，在8000 r/min，5 ℃下離心10 min，取上清酒液，用于酒精度、酸度和總黃酮的測定。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 野葛全粉與野葛淀粉比例對葛根酒的影響

野葛全粉和野葛淀粉按照1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5進行調配，按淀粉含量進行換算，使調配后的淀粉含量分別為57%、63%、67%和70%，再分別調整料液比，使得發(fā)酵初始淀粉溶液濃度為20 g/100 mL，發(fā)酵結束后測定酒樣酒精度和總黃酮含量。

1.2.2.2 料液比對葛根酒的影響

采用野葛全粉和野葛淀粉按照一定比例調配后，按1∶2.0、1∶1.8、1∶1.6、1∶1.4 和1∶1.2 的料液比進行處理發(fā)酵，直至無顯著氣泡產生，發(fā)酵結束，測定各項指標。

1.2.2.3 糖化時間對濃醪發(fā)酵型葛根酒的影響

野葛全粉和野葛淀粉按照一定比例調配后，料液比按1∶1.6，考察糖化時間0 min、15 min、30 min、45 min和60 min對發(fā)酵后葛根酒質量的影響。

1.2.3 響應面設計優(yōu)化料液比和糖化酶用量

從以上實驗發(fā)現(xiàn)糖化過程和料液比對濃醪發(fā)酵葛根酒的酒度和總黃酮含量影響較大，因此本實驗采用中心組合設計（CCD）原理，以料液比和糖化酶用量為響應變量，以酒度和總黃酮含量為響應值，進行2 因素3 水平響應面分析實驗。實驗方案設計見表1，然后按1.2 中的實驗方法進行液化，糖化工藝改為：液化結束后，降溫至30 ℃，再加入不同水平的糖化酶。發(fā)酵結束后，測定各指標。

表1 中心組合設計水平及編碼

1.2.4 原料成分分析

均采用國家標準方法：淀粉，GB 5009.9—2016酶水解法；蛋白質，GB 5009.5—2016 凱氏定氮法；粗脂肪，GB 5009.6—2016 索氏抽提法；灰分，GB 5009.4—2016 食品中總灰分的測定；水分，GB 5009.3—2016直接干燥法。

1.2.5 葛根總黃酮的測定

紫外分光光度法[8]。以75%vol 的乙醇將葛根素稀釋至合適的濃度梯度，在250 nm 處測吸光值，制作標準曲線。酒液總黃酮的測定，采用75 %vol乙醇稀釋至合適倍數(shù)后，直接測定。葛根中總黃酮的測定，采用75 %vol 乙醇，經超聲提取、過濾、定容，并稀釋到合適倍數(shù)后測定。

1.2.6 酒精度和酸度的測定

酒精度：密度計法[9]。酸度：10 mL酒液，以酚酞為指示劑，用0.1 mol/L NaOH 標準溶液滴定，消耗1 mL 0.1 mol/L NaOH 標準溶液為1 度。吸取酒液1 mL，加入250 mL 三角瓶中，加水50 mL，加酚酞指示劑2 滴，用0.1 mol/L NaOH 標準溶液滴定，滴定至溶液呈微紅色并在30 s內不褪色為終點[10]。

2 結果與分析

2.1 葛根成分分析

野葛和粉葛均含有大量的淀粉和葛根異黃酮等功能性成分。由表2 可見，野葛和粉葛在淀粉和總黃酮上差異較大，野葛淀粉含量達到26%，粉葛淀粉含量為51%；但野葛中的總黃酮為12.7%，遠大于粉葛的2.4%。該結果與有關文獻報道的結果相類似[11-12]。

葛根中淀粉含量，遠低于谷物，故純葛根發(fā)酵后的酒度較低，口感較差，并且葛根素等黃酮類物質在水中的溶解度沒有醇溶液的高，因此提高發(fā)酵的終酒度有利于葛根素的溶出[7，13]。為了提高酒精度，則需要提高料液比，或增加醪液的總淀粉含量。因此近些年文獻報道的葛根酒，多為葛根與高粱、糯米、玉米、大米等常用釀酒原料一起混合發(fā)酵，有的則直接配入蔗糖或葡萄糖，以提高發(fā)酵的酒精度和產品的口感。但加入較高比例的谷物，會使葛根素等異黃酮類的終濃度下降。在不添加外源糖類物質葛根酒的預實驗中發(fā)現(xiàn)，當料液比小于1∶3 進行調漿時，發(fā)現(xiàn)醪液較黏稠，主要原因是葛根中含有大量的纖維素，吸水性強，從而影響后續(xù)液化和糖化。因此為了從根本上解決發(fā)酵葛根酒的品質問題，獲得酒精度和功能性成分含量較高的葛根酒，本實驗采用野葛全粉和野葛淀粉（淀粉88.6%，葛根素≥75 mg/kg）配伍，進行濃醪發(fā)酵。

表2 野葛和粉葛主要組成成分分析 (g/100 g)

2.2 野葛全粉與野葛淀粉比例對葛根酒的影響（表3）

表3 野葛全粉和野葛淀粉比對葛根酒酒精度和葛根總黃酮的影響

由表3可知，在野葛全粉和淀粉的不同配比下，葛根酒的酒精度無顯著性差異，均在13.3 %vol～13.7%vol 之間。但總黃酮含量卻隨野葛全粉占比的減小，從19.8 mg/mL 減少至7.4 mg/mL。這主要是由于野葛全粉中的總黃酮含量遠大于其淀粉中總黃酮的含量，因此在葛根全粉占比減小時，總黃酮的含量逐漸降低。為此，在考慮配伍后的淀粉濃度的情況下，野葛全粉和野葛淀粉的配比選用1∶1。

2.3 料液比對葛根酒的影響（圖1）

圖1 料液比對葛根酒質量的影響

如圖1 所示，隨著料液比的增加，葛根酒中的酒精度略有上升，但從1∶1.8后顯著降低；總黃酮含量隨料液比增加而略增加，但酸度也隨之增加。實驗結果表明，料液比增大，可為乙醇發(fā)酵提供碳源來源，但是當增加到一定程度后，由于方法中的糖化時間較長，過大的料液比會使糖化后的葡萄糖濃度增高，初期過高的滲透壓影響酵母的生長代謝，同時產生有機酸等副產物[14-15]。由于有機酸的增加，本實驗中的酸度值隨料液比的增大而增大。此外，由于料液比的增大，會使原料中的總黃酮濃度增大，酒液中的總黃酮濃度也隨之增大。因此，糖化程度和料液比是葛根濃醪發(fā)酵的兩個重要因子。

2.4 糖化時間對濃醪發(fā)酵型葛根酒的影響（圖2）

圖2 糖化時間對濃醪發(fā)酵型葛根酒的影響

目前許多文獻中葛根糖化工藝均使醪液中的淀粉一次性均轉化為可利用的還原性糖類。但對于濃醪發(fā)酵，醪液經糖化后就會增加初始糖濃度和體系滲透壓，較高的滲透壓會降低細胞膜中磷脂雙分子層的流動性，底物難以進入細胞中，乙醇也難以擴散到胞外，糖酵解途徑酶的活性也被抑制，酵母的發(fā)酵力和活性下降，抑制了乙醇的生成，同時產生副產物，從而不利于酵母的生長和乙醇的代謝[15]。邊糖化邊發(fā)酵工藝（SSF）可防止醪液的滲透壓升高，例如李志軍等[16]以玉米為原料添加20 U淀粉酶/g 原料，90～95 ℃液化，采用邊糖化邊發(fā)酵工藝，發(fā)酵酒度達到13.6%vol。

由圖2 可知，隨著糖化時間的增加，酒精度和總黃酮含量均逐漸下降，而酸度逐漸升高。在本實驗料液比一定的情況下，隨著糖化時間的增加，初始糖濃度逐漸增加，過高的糖濃度，使前期發(fā)酵過快，產熱和產酸增大，同時會增加發(fā)酵液的滲透壓，這些都會影響酵母的正常生長代謝。當液化結束時，醪液中已經含有相當濃度的單糖，因此糖化時間為0 min 時，即采用邊糖化邊發(fā)酵工藝（SSF），酵母依然有可利用的單糖。此后，在糖化酶的作用下，低分子量的糊精和寡糖分子逐漸被水解成單糖，從而解除了濃醪發(fā)酵過程中，初始糖濃度過高對乙醇發(fā)酵的不利影響。此外有文獻表明[7]，酒精度的增加會促進酒液中總黃酮含量的增加，這主要是由于葛根異黃酮類物質更易溶于乙醇，這與本實驗結果相符。

2.5 響應面設計優(yōu)化料液比和糖化酶用量

從以上實驗發(fā)現(xiàn)糖化過程和料液比對濃醪發(fā)酵型葛根酒的酒精度和葛根總黃酮含量影響較大，因此本實驗采用中心組合設計（CCD）原理，實驗結果見表4。

表4 響應面中心組合設計和實驗結果

2.5.1 酒度響應值回歸模型的方差分析

利用Dsign-expert 對表4 中的酒度值數(shù)據(jù)進行擬合得到的編碼二次多項式方程為：Y=15.02-0.27A-0.14B-0.075AB-1.64A2-0.34B2（1）

由公式（1）中的系數(shù)和圖3 可知，該方程的拋物面向下，該模型有最大值。采用Design-expert 對酒精度值進行多元回歸分析，方差分析結果見表5。如表5 所示，該模型P 值遠小于0.05，表明該模型在95 %的概率水平下是顯著的；該模型的失擬項為P=0.4227，大于0.05，不顯著，表明未知因素對該模型實驗結果的干擾較小，不需要再引入其他的因素；且該模型的相關系數(shù)R2=0.9606，表明了酒精度值的變化有96.06 %的概率是由該模型決定的，并說明實驗中酒精度的實際值與模型預測值有較高的一致性。因此，該模型較能準確的對實驗結果進行預測。

圖3 酒精度響應面三維圖

表5 酒精度響應值的二次多項式回歸模型的方差分析

2.5.2 葛根總黃酮響應值的回歸模型的方差分析

利用Dsign-expert 對表4 中的總黃酮數(shù)據(jù)進行擬合得到的編碼二次多項式方程為：Y=25.06+2.67A-0.58B-0.025AB-1.25A2-0.85B2（2）

由公式（2）中的系數(shù)和圖4 可知，該方程的拋物面向下，該模型有最大值。采用Design-expert 對酒精度值進行多元回歸分析，方差分析結果見表6。如表6 所示，該模型P 值為0.0016，遠小于0.05，表明該模型在95 %的概率水平下是顯著的；而該模型的失擬項P 值為0.6671，大于0.05，不顯著，表明未知因素對該模型實驗結果的干擾較小，不需要再引入其他的因素；且該模型的相關系數(shù)R2=0.9081，表明了酒精度值的變化有90.81 %的概率是由該模型決定的，并說明實驗中酒精度的實際值與模型預測值有較高的一致性。因此，該模型較能準確的對實驗結果進行預測。

圖4 總黃酮響應面三維圖

表6 葛根總黃酮響應值的二次多項式回歸模型的方差分析

2.5.3 最優(yōu)條件的確定與驗證

采用Design-expert 在同時考慮酒精度和葛根總黃酮含量的情況下，得出最優(yōu)條件為料液比0.63（1∶1.587），糖化酶用量為256.2 U/g，此時的酒精度預測值為14.8%vol，總黃酮預測值為25.8 mg/mL。在該最優(yōu)條件下進行實驗，酒精度實測值為15.2 %vol，總黃酮實測值為25.9 mg/mL，該值與預測值接近。

3 結果與討論

在考察了野葛和粉葛基本組成成分的基礎上，采用野葛全粉和野葛淀粉配伍進行濃醪發(fā)酵葛根酒的研制，以發(fā)酵后酒液的酒精度和總黃酮的含量為目標，對野葛全粉和野葛淀粉的配伍比例、料液比、糖化時間進行初步優(yōu)化，并使用響應面中心組合實驗確定料液比和糖化酶的用量，得到最佳工藝條件為：野葛全粉和野葛淀粉按1∶1 配比，料液比為1∶1.587，糖化酶用量為256.2 U/g，糖化時間為0 min時，酒精度為15.2 %vol，總黃酮為25.9 mg/mL，在此條件下，酒精度和總黃酮含量均較高。

野葛和粉葛在淀粉和總黃酮含量差異較大，其中野葛的總黃酮含量遠高于粉葛，在制備葛根產品時，應根據(jù)實際需要選用合適的品種。為了獲得活性成分高的葛根酒，應選用野葛進行發(fā)酵。為了克服野葛全粉中淀粉含量低的缺陷，采用與野葛淀粉配伍使用，進行發(fā)酵，取得較好結果。料液比和糖化程度對葛根酒的酒精度和總黃酮含量影響較大。其中，料液比過大時，雖然一定程度上可提高總黃酮的含量，但過高時，由于醪液過于濃稠，初始糖濃度大，滲透壓高，反而不利于發(fā)酵。當糖化時間為0 min，即采用邊糖化邊發(fā)酵工藝后，可顯著解決葛根濃醪發(fā)酵過程的這一問題。并采用響應面中心組合設計，對料液比和糖化酶的用量做出了更為精確的優(yōu)化，取得較好效果。但野葛中含有大量的纖維素成分，該成分很大程度上阻礙了葛根酒的酒精度和總黃酮含量的提升，因此在發(fā)酵過程中可對去除或轉化纖維素進一步研究。