喬海清，王曉濱，白一彤，辛海燕，王 婷，李建兵*

(1.青島市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，山東 青島 266101；2.國家海洋精細(xì)化工及其生物制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，山東 青島 266101)

農(nóng)藥是一類重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料，主要用于防治有害生物，保證農(nóng)業(yè)增產(chǎn)豐收，提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)前至產(chǎn)后的全過程[1]。近年來，農(nóng)藥產(chǎn)品質(zhì)量有所提高，但是非法添加隱性成分依舊是農(nóng)藥質(zhì)量不合格的重點(diǎn)問題，有些不法分子為了牟取利潤，在農(nóng)藥產(chǎn)品中添加除標(biāo)簽和說明書標(biāo)注以外的農(nóng)藥成分，給農(nóng)藥監(jiān)管帶來了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[2]。農(nóng)藥中非法添加成分不僅會(huì)造成農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留超標(biāo)，影響食品安全，危害人身體健康，還會(huì)危及生態(tài)環(huán)境安全，造成農(nóng)藥行業(yè)的不良競(jìng)爭(zhēng)，因此必須采取有效措施對(duì)非法添加成分進(jìn)行有效監(jiān)管[3～4]。目前檢測(cè)農(nóng)藥非法添加成分的方法主要有GC-MS，HPLC-MS/MS，UPC-Q-TOF法，但是這些儀器昂貴，使用和維護(hù)成本高，而液相色譜基層實(shí)驗(yàn)室常配備，更有利于方法的推廣[5]。

本文選取了常見的92種非法添加物，建立了HPLC-DAD快速篩查方法，根據(jù)保留時(shí)間和DAD-UV光譜圖數(shù)據(jù)庫對(duì)非法添加成分進(jìn)行分析，并對(duì)實(shí)際農(nóng)藥產(chǎn)品進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑 儀器：P680A液相色譜儀配有二極管陣列檢測(cè)器，戴安；電子天平(AB265-S，0.01 mg)，METTLER TOLEDO；電子天平(ME204，0.1 mg)，METTLER TOLEDO。

試劑：甲醇、乙腈，HPLC級(jí)，CNW

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：2,4-滴，阿維菌素，百菌清，倍硫磷，苯醚甲環(huán)唑，吡丙醚，吡蟲啉，吡蚜酮，吡唑醚菌酯，丙環(huán)唑，丙溴磷，溴蟲腈，噠螨靈，噠嗪硫磷，敵敵畏，丁硫克百威，丁醚脲，啶蟲脒，毒死蜱，二甲戊靈，二嗪磷，伏殺硫磷，氟胺氰菊酯，氟蟲腈，氟啶脲，氟硅唑，氟鈴脲，氟氯氰菊酯，氟氰戊菊酯，福美雙，腐霉利，己唑醇，甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽，甲胺磷，甲拌磷，甲草胺，甲基毒死蜱，甲基對(duì)硫磷，甲基硫菌靈，甲基異柳磷，甲氰菊酯，甲霜靈，腈菌唑，久效磷，抗蚜威，克百威，喹硫磷，喹螨醚，樂果，聯(lián)苯菊酯，螺螨酯，氯蟲苯甲酰胺，氯菊酯，氯氰菊酯，氯噻啉，氯唑磷，馬拉硫磷，醚菊酯，嘧菌酯，嘧霉胺，滅多威，滅線磷，滅蠅胺，氰戊菊酯，炔螨特，噻蟲啉，噻蟲嗪，噻螨酮，噻嗪酮，三氯殺螨醇，三氯殺螨砜，三唑酮，殺螟丹，殺螟硫磷，殺撲磷，霜脲氰，水胺硫磷，特丁硫磷，戊唑醇，烯啶蟲胺，烯酰嗎啉，辛硫磷，溴氰菊酯，煙嘧磺隆，氧樂果，乙霉威，乙酰甲胺磷，異丙威，茚蟲威，蠅毒磷，仲丁威，唑蟲酰胺，Dr.Ehrenstorfer。

1.2 方法

1.2.1 液相色譜條件 Thermo Hypersil Gold C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相A：0.1%磷酸溶液，流動(dòng)相B：甲醇-乙腈(質(zhì)量比50：50)，流速1.0mL/min，進(jìn)樣量10μL，梯度洗脫程序(表1)。采用二極管陣列檢測(cè)器，波長掃描范圍：190nm～400nm，光譜步進(jìn)值：1.0 nm，光譜采集模式：全部。

表1 92種非法添加農(nóng)藥分離的梯度洗脫程序

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 農(nóng)藥單標(biāo)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取10mg(精確到0.01mg)各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品于10mL容量瓶中，加入甲醇溶解，并定容至刻度線，各農(nóng)藥儲(chǔ)備液濃度為1 000mg/L。

農(nóng)藥單標(biāo)使用液：準(zhǔn)確移取100uL單標(biāo)儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相定容于10mL容量瓶中，混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。

農(nóng)藥混標(biāo)工作液：準(zhǔn)確移取不同體積單標(biāo)儲(chǔ)備液，用甲醇定容于10mL容量瓶中，混勻，配制混標(biāo)溶液。

1.3 樣品前處理 本實(shí)驗(yàn)針對(duì)可濕性粉劑和乳油等常見的農(nóng)藥產(chǎn)品進(jìn)行樣品處理。稱取適量樣品于50mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲15min，放冷至室溫。加甲醇定容至刻度線，混勻?？蓾裥苑蹌悠沸桦x心過濾后待測(cè)，乳油樣品直接過濾待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理的選擇 不同制劑農(nóng)藥產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中會(huì)加入不同的助劑。乳油產(chǎn)品加入有機(jī)溶劑和助溶劑如甲醇、乙腈和丙酮等，懸浮劑產(chǎn)品加入分散劑和潤濕劑等，可加入甲醇直接超聲提取測(cè)定?？蓾裥苑蹌┊a(chǎn)品加入載體，如硅藻土和高嶺土等，不溶于甲醇，需提取離心過濾后測(cè)定[6]。

2.2 液相色譜條件的選擇 本研究采用Thermo Hypersil Gold C18柱進(jìn)行分析，流動(dòng)相A為0.1%磷酸溶液，流動(dòng)相B為甲醇-乙腈(質(zhì)量比50：50)。甲醇梯度洗脫產(chǎn)生的柱壓比乙腈大，但是甲醇更有利于農(nóng)藥成分的保留以及基質(zhì)雜質(zhì)的洗脫，從而減少雜質(zhì)在色譜柱中的保留，延長色譜柱的壽命，在流動(dòng)相中加入酸可得到更優(yōu)的峰形和分離效果[6～7]，因此選用0.1%磷酸溶液和甲醇-乙腈體系作為流動(dòng)相。

多農(nóng)藥的分析需要相對(duì)平緩的液相洗脫梯度，減少基質(zhì)對(duì)目標(biāo)分析物的干擾，并采用大梯度洗脫方式，使各種農(nóng)藥都有較好的分離度[8]，在分析過程中水相起始比例為80%，在28min內(nèi)緩慢變化到10%，再在15min內(nèi)變化到80%。

2.3 數(shù)據(jù)庫的建立 在固定色譜條件下，化合物的保留時(shí)間是相對(duì)固定的。在進(jìn)行未知物檢測(cè)時(shí)，在同樣色譜條件下，未知物的保留時(shí)間與已知化合物一致時(shí)，則可認(rèn)為是同一種物質(zhì)。但該方法需提前使用相同的色譜柱，在相同色譜條件下對(duì)已知化合物建立保留時(shí)間數(shù)據(jù)庫來提高定性的準(zhǔn)確性[9～10]。在1.2.1 液相色譜條件下對(duì)農(nóng)藥單標(biāo)使用液進(jìn)行測(cè)定，得到各農(nóng)藥成分的保留時(shí)間(表2)；92種非法添加農(nóng)藥混標(biāo)的3D色譜圖(圖1)。

表2 92種農(nóng)藥的保留時(shí)間和最大吸收波長

續(xù)表

續(xù)表

圖1 92種非法添加混合標(biāo)物的3D色譜圖

HPLC-DAD法可以分析待測(cè)物的紫外光譜信息，根據(jù)各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的DAD-UV光譜圖建立92種非法添加農(nóng)藥的光譜圖數(shù)據(jù)庫。從表2可以發(fā)現(xiàn)，丁硫克百威和克百威的保留時(shí)間非常接近，但是其DAD-UV光譜圖有明顯差別(圖2)。如圖2所示甲霜靈和甲氰菊酯的光譜圖非常相似，但是其保留時(shí)間差別很大(表2)。因此可以預(yù)先建立相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫，通過保留時(shí)間和DAD光譜圖對(duì)非法添加農(nóng)藥進(jìn)行確證[11]。

圖2 丁硫克百威、克百威、甲霜靈和甲氰菊酯DAD-UV光譜圖

2.4 典型樣品測(cè)定 對(duì)已知含非法添加農(nóng)藥樣品按照1.3處理，按照1.2.1液相色譜條件分析，根據(jù)保留時(shí)間和DAD-UV光譜數(shù)據(jù)庫索引，發(fā)現(xiàn)3.2%阿維菌素乳油中含有螺螨酯，25%吡蟲啉可濕性粉劑中含有滅多威(圖3)。

圖3 農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)DAD圖和典型性樣品DAD光譜圖及液相色譜圖

3 結(jié)論

針對(duì)乳油和可濕性粉劑常見農(nóng)藥制劑建立了92種非法添加成分的高效液相色譜-DAD快速篩查法。非法添加成分種類繁多，極性相差很大，采用大梯度洗脫方式進(jìn)行分析。通過預(yù)先建立保留時(shí)間和DAD-UV光譜數(shù)據(jù)庫對(duì)農(nóng)藥產(chǎn)品中的非法添加成分進(jìn)行確證，該方法快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，檢測(cè)成本低，可以用于非法添加成分的快速篩查。