王志敏 李建欣 白 艷

糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)是糖尿病患者常見的并發(fā)癥之一，在2型糖尿患者中發(fā)生率能達(dá)到60%～90%[1]，其發(fā)生與糖尿病患者機(jī)體慢性炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[2]。NLRP3炎性小體是一種存在于細(xì)胞質(zhì)中的蛋白復(fù)合物，依賴半胱天冬蛋白酶-1(caspase-1)的分子平臺(tái)促進(jìn)白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和IL-18的成熟和釋放，并引起炎癥反應(yīng)[3]。研究[4]指出，NLRP3炎性小體激活是糖尿病發(fā)展的重要環(huán)節(jié)之一，一旦體內(nèi)對(duì)NLRP3炎性小體的調(diào)控失衡，可能生成過量的IL-1β、IL-18，引發(fā)一系列的糖尿病并發(fā)癥。西醫(yī)治療DPN主要以降糖、降脂、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)、改善微循環(huán)等綜合性治療，但由于DPN的發(fā)病機(jī)理尚不十分明確，影響因素復(fù)雜多樣，目前仍缺乏有效的治療方法。在中醫(yī)范疇中，糖尿病被稱為消渴癥，基本病機(jī)是陰虛為本，燥熱為標(biāo)，故清熱潤(rùn)燥、養(yǎng)陰生津?yàn)楸静〉闹委熀诵淖谥?。既往研究[5，6]證明，益氣活血滋陰治療糖尿病相關(guān)并發(fā)癥，可以有效緩解并發(fā)癥相關(guān)癥狀，改善相關(guān)指標(biāo)水平，提高患者的生存質(zhì)量，但目前此方面的研究尚無關(guān)于是否能改變炎性指標(biāo)的結(jié)論。因此，我院在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上，結(jié)合自擬活血益氣滋陰方治療DPN患者，觀察NLRP3及其下游炎癥因子的水平變化，旨在為臨床應(yīng)用提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2019年1月—2019年12月于我院住院治療的DPN患者152例，其中，男84例，女68例；年齡38～65歲，平均年齡(57.46±6.57)歲；病程4.5～11年，平均病程5.68(2.30，9.91)年。采用隨機(jī)數(shù)字表法，將研究對(duì)象隨機(jī)分為研究組和對(duì)照組均76例，2組性別比例、年齡、糖尿病病程、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、血糖控制情況等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性(P>0.05)，見表1。本研究設(shè)計(jì)符合《赫爾辛基宣言》標(biāo)準(zhǔn)。

表1 2組患者一般資料比較 [例，

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)T2DM和DPN西醫(yī)診斷符合《中國(guó)2型糖尿病防治指南(2017年)》[7]診斷標(biāo)準(zhǔn)：①明確的糖尿病病史；②診斷糖尿病時(shí)或之后出現(xiàn)的神經(jīng)病變；③臨床癥狀和體征與DPN的表現(xiàn)相符；④有臨床癥狀(疼痛、麻木、感覺異常等)者，5項(xiàng)檢查(踝反射、針刺痛覺、震動(dòng)覺、壓力覺、溫度覺)中任1項(xiàng)異常；無臨床癥狀者，5項(xiàng)檢查中任2項(xiàng)異常，臨床診斷為DPN。中醫(yī)診斷符合《糖尿病周圍神經(jīng)病變中醫(yī)防治指南》標(biāo)準(zhǔn)[8]：①有糖尿病病史或診斷糖尿病的證據(jù)；②出現(xiàn)感覺、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病變的臨床表現(xiàn)；③神經(jīng)電生理檢查異常改變，物理學(xué)檢查、感覺定量試驗(yàn)和神經(jīng)傳導(dǎo)速度中至少2項(xiàng)異常。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)①年齡>18歲；②T2DM和DPN診斷符合《中國(guó)2型糖尿病防治指南(2017年)》[7]診斷標(biāo)準(zhǔn)；③中醫(yī)診斷符合《糖尿病周圍神經(jīng)病變中醫(yī)防治指南》[8]標(biāo)準(zhǔn)；④簽署知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)①合并其他原因引起的神經(jīng)病變；②合并嚴(yán)重動(dòng)靜脈血管性病變；③合并惡性腫瘤、嚴(yán)重心血管疾病、嚴(yán)重肝腎功能不全；④因藥物引起神經(jīng)毒性和代謝毒物造成神經(jīng)損傷；⑤1型糖尿病、特殊類型糖尿??；⑥對(duì)試驗(yàn)藥物過敏；⑦妊娠期和哺乳期女性。

1.5 方法

1.5.1 治療方法2組均接受常規(guī)降糖、降壓、降脂、改善微循環(huán)及飲食運(yùn)動(dòng)干預(yù)等基礎(chǔ)治療。對(duì)照組在此基礎(chǔ)上給予甲鈷胺片(華北制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20031126)口服，3次/d，每次0.5 mg。研究組在基礎(chǔ)治療的同時(shí)，聯(lián)合使用活血益氣滋陰方湯劑，藥物組成：生姜180 g，麥冬100 g，五味子80 g，川芎60 g，當(dāng)歸60 g，熟地黃60 g，人參60 g，桂心60 g，炙甘草60 g，遠(yuǎn)志60 g，龍骨60 g，黃芪30 g，茯苓30 g，大棗20枚，羊腎1枚。制作過程為先煮羊腎，取汁煎余下藥材，早晚各服用1次，30 d為一個(gè)療程，連用3個(gè)療程(3個(gè)月)。

1.5.2 觀察指標(biāo)分別于干預(yù)前、干預(yù)1個(gè)月及干預(yù)3個(gè)月后，收集相關(guān)指標(biāo)。①Western blot檢測(cè)NLRP3和Caspase-1水平：收集患者空腹肘靜脈血5 ml，采用磁珠復(fù)篩法分離外周血單核細(xì)胞，試劑盒購(gòu)自上海澳賽爾斯生物技術(shù)有限公司，將細(xì)胞濃度調(diào)整至5×105個(gè)/ml備用，整個(gè)操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。采用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS，HyClone公司)清洗細(xì)胞并離心3次，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后用細(xì)胞裂解液提取總蛋白，收集細(xì)胞沉淀及裂解液，BCA蛋白定量。然后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉(TTBS緩沖液配置)封閉，4 ℃孵育過夜。分別加入NLRP3、Caspase-1及β-actin一抗(5%脫脂奶粉，1∶1000)，37 ℃孵育4 h，TTBS洗膜，后加入二抗(1∶50000)，37 ℃孵育1 h，TTBS洗膜，加入ECL試劑，曝光，顯影，定影，采用Gel-protein軟件分析條帶灰度。②酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)IL-1β和IL-18的表達(dá)水平：收集空腹肘靜脈血5 ml，室溫靜置，離心分離血清，并置于-80 ℃冰箱保存，采用ELISA檢測(cè)IL-1β和IL-18的表達(dá)水平，試劑盒由加拿大MyBioSource公司生產(chǎn)，購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司，操作步驟嚴(yán)格按照使用說明書進(jìn)行，批間與批內(nèi)的變異系數(shù)均<10%。

1.5.3 質(zhì)量控制患者每月于門診復(fù)診時(shí)，門診醫(yī)師根據(jù)患者檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行常規(guī)治療方案調(diào)整，并給予飲食運(yùn)動(dòng)教育，但甲鈷胺及中藥方劑治療方案持續(xù)3個(gè)月。在觀察期間出現(xiàn)糖尿病急性并發(fā)癥、急性感染、嚴(yán)重外傷、家中出現(xiàn)變故等應(yīng)激事件者，為避免對(duì)數(shù)據(jù)的影響導(dǎo)致結(jié)果的偏差，故以上情況患者數(shù)據(jù)不納入最終的統(tǒng)計(jì)。研究中涉及的Western blot實(shí)驗(yàn)及ELISA檢測(cè)均在濮陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成，由李建欣教授指導(dǎo)，所有操作嚴(yán)格按照產(chǎn)品使用說明書進(jìn)行，批內(nèi)及批間差異<10%。

2 結(jié)果

2.1 2組患者不同時(shí)間點(diǎn)NLRP3表達(dá)水平的比較重復(fù)測(cè)量的方差分析顯示，不同時(shí)間點(diǎn)NLRP3表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F時(shí)間=117.372，P<0.001)；對(duì)照組和研究組不同時(shí)間點(diǎn)NLRP3表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=89.341，P<0.001)；測(cè)量前后與干預(yù)之間存在交互效應(yīng)(F交互=45.662，P<0.001)，見表2。

表2 2組患者不同時(shí)間點(diǎn)NLRP3表達(dá)水平的比較 (例，

2.2 2組患者不同時(shí)間點(diǎn)炎癥因子水平的比較重復(fù)測(cè)量的方差分析顯示，不同時(shí)間點(diǎn)Caspase-1、IL-1β及IL-18表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F時(shí)間=105.441、117.384、129.516，P<0.001)；對(duì)照組和研究組不同時(shí)間點(diǎn)Caspase-1、IL-1β及IL-18表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=67.376、46.364、58.610，P<0.001)；測(cè)量前后與干預(yù)之間存在交互效應(yīng)(F交互=27.348、25.358、16.555，P<0.001)，見表3。

表3 2組患者不同時(shí)間點(diǎn)炎癥因子水平的比較 (例，

3 討論

NLRP3炎性小體是核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族NALP組成員之一，與許多炎性疾病有關(guān)，如阿爾茲海默癥、心力衰竭、慢性阻塞性肺疾病等[9]。研究[10]指出，NLRP3炎癥小體及其下游炎癥因子激活是糖尿病發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，在糖尿病慢性并發(fā)癥中，受到細(xì)胞內(nèi)特定信號(hào)刺激時(shí)，NLRP3發(fā)生寡聚化，通過PYD結(jié)構(gòu)域招募凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)及下游的Caspase-1形成多蛋白復(fù)合物，是炎性免疫反應(yīng)的重要組成部分，其主要作用是誘導(dǎo)后者自我剪切成活化的Caspase-1，促進(jìn)IL-lβ和IL-18激活，產(chǎn)生成熟的具有活性的IL-lβ和IL-18，促進(jìn)其他炎性細(xì)胞因子的合成和釋放，放大局部和全身炎癥反應(yīng)，這其中氧化應(yīng)激發(fā)揮出了非常重要的作用。因此，NLRP3炎性小體成為近年來糖尿病慢性病并發(fā)癥研究的“新靶點(diǎn)”。

目前，DPN的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，對(duì)于DPN的預(yù)防和治療造成了一定的影響，但普遍認(rèn)為其與糖脂代謝異常、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、微血管病變有關(guān)。由于NLRP3炎癥小體在糖尿病慢性并發(fā)癥中的重要地位，尋找靶向于NLRP3炎癥小體的治療藥物就具有深遠(yuǎn)意義。中醫(yī)學(xué)對(duì)于DPN治療具有悠久的歷史，其在中醫(yī)學(xué)中被歸為“痹證”“血痹”“痿證”等治療范疇，認(rèn)為該病主要是由于患者消渴日久，耗損氣陰、真陰日益衰損繼而及陽(yáng)，最終導(dǎo)致陰陽(yáng)氣血虛弱，營(yíng)衛(wèi)失調(diào)、陽(yáng)虛則血行無力，瘀血凝滯脈絡(luò)，阻礙血?dú)庹＿\(yùn)行，使其不能上達(dá)四末而至脈絡(luò)損傷，臨床表現(xiàn)為“麻、涼、痛、痿”。中醫(yī)學(xué)[11]認(rèn)為，氣虛血瘀始終貫穿于DPN發(fā)展的始終，其中病機(jī)是氣陰皆虛、夾以血淤，本虛證和標(biāo)實(shí)證動(dòng)態(tài)演變，氣虛是遷移不愈的癥結(jié)，血瘀是造成本病的主因。因此，本病的臨床治療離不開益氣、活血、滋陰等療法[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過3個(gè)月的干預(yù)后，2組NLRP3炎性小體及其下游炎癥因子Caspase-1、IL-1β及IL-18的表達(dá)水平均降低，提示經(jīng)過常規(guī)的降糖、降脂、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)、改善微循環(huán)的治療后，DPN患者炎癥狀態(tài)得到了一定的改善，進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，研究組患者1個(gè)月和3個(gè)月時(shí)，Caspase-1、IL-1β及IL-18表達(dá)水平低于對(duì)照組(P<0.001)，說明給予活血益氣滋陰方治療后，效果更為明顯。中藥具有雙向調(diào)節(jié)、多靶點(diǎn)、多途徑的優(yōu)點(diǎn)，目前關(guān)于中藥復(fù)方干預(yù)NLRP3炎癥小體的研究較少。既往研究[6]證實(shí)，益氣活血中醫(yī)治療能夠改善DPN患者氣虛血瘀癥狀，緩解局部不適，效果好于甲鈷胺單藥治療?；钛鏆庾剃幏皆谂湮樯蠂?yán)格遵循“君、臣、佐、使”的要求，以補(bǔ)陰為主，氣陰同治，兼顧痰瘀，清化濕熱，注重脾運(yùn)，以達(dá)到五臟六腑通達(dá)平和的良好狀態(tài)。在方劑中，君為黃芪、麥冬，補(bǔ)氣固表、滋陰補(bǔ)血。黃芪可補(bǔ)中益氣，改善營(yíng)血虛滯，其藥理成分中的黃芪多糖可清除自由基，抗脂質(zhì)氧化，保護(hù)線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，在機(jī)體抗氧化應(yīng)激中起重要作用[13]。麥冬具有滋陰生津、健脾益氣的功能，用于治療內(nèi)熱消渴，現(xiàn)代藥理研究[14]證明，麥冬具有抗炎、抗氧化、降糖降脂的作用，其總皂苷及各部位提取物對(duì)改善炎癥均具有較好的作用。臣為熟地黃，通血脈，益氣力，主治氣血兩虛、肝腎虧虛、腎陽(yáng)虛證等，其水提取液能通過上調(diào)T2DM大鼠胰島素原基因mRNA與蛋白的表達(dá)和抑制脂肪組織resistin基因的表達(dá)，改善胰島β細(xì)胞功能[15]，且在家兔中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)[16]證明，熟地黃可以抑制血漿cAMP含量過高及cAMP/cGMP比值過高，具有抗炎的作用。另外，方劑中再配以五味子、當(dāng)歸、炙甘草、桂心、茯苓、人參、川芎等，分別歸為臣藥、佐藥、佐使藥，起到益氣生津、溫補(bǔ)氣血、補(bǔ)氣健脾、通絡(luò)活血等作用。

綜上所述，在糖尿病常規(guī)治療的基礎(chǔ)上給予活血益氣滋陰方，可以降低DPN患者NLRP3炎性小體及其下游炎癥因子Caspase-1、IL-1β及IL-18的表達(dá)水平，但本文無法證明導(dǎo)致NLRP3炎性小體及其下游炎癥因子下降的具體機(jī)制，且目前中醫(yī)學(xué)在此方面的研究較少，此結(jié)論還有待進(jìn)一步確定。