陳如敬，吳學敏，陳秋勇，車勇良，王隆柏，嚴 山，周倫江

（福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所/福建省畜禽疫病防治工程中心，福建 福州 350013）

0 引言

【研究意義】截至目前，豬群中發(fā)現(xiàn)存在3 種圓環(huán)病毒：豬圓環(huán)病毒1 型（Porcine circovirus 1, PCV 1）[1]、豬圓環(huán)病毒2 型（Porcine circovirus 2, PCV2）[2]和近年來新發(fā)的豬圓環(huán)病毒3 型（Porcine circovirus 3, PCV3）[3-4]。根據(jù)國際病毒分類委員會的最新分類，PCV1、PCV2 和PCV3 均屬于圓環(huán)病毒科（Circoviridae）圓環(huán)病毒屬（Circovirus）成員。PCV3在美國、中國、日本、韓國、瑞典、俄羅斯、泰國、巴西、丹麥、意大利、西班牙等豬群中均有報道[5]。此外，流行病學調(diào)查還發(fā)現(xiàn)豬群中存在多種其他病原和PCV3 混合感染，且PCV3 在野豬中也廣泛流行[6-7]。一般認為，PCV1 對豬群不致病，而PCV2是當前豬群中最為重要的致病病原之一；但是關于PCV3 是否存在致病性，目前還存在一定的爭議，這主要和當前缺乏對PCV3 的有效培養(yǎng)有關[8-10]。因此，亟待開發(fā)一種特異、敏感、快速的檢測方法用于開展PCV3 流行病學調(diào)查和致病機制研究?！厩叭搜芯窟M展】目前，PCV3 的檢測已見有SYBR I 實時熒光定量PCR 方法[11]、重組酶擴增方法（Recombinase polymerase amplification, RPA）[12]、環(huán)介導等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）[13-14]和酶聯(lián)免疫吸附測定法（Indirect enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）[15]、 數(shù) 字 PCR 方 法（Droplet Digital PCR）[16]等。對GenBank 中PCV3 序列進行分析發(fā)現(xiàn)，PCV3 基因組全長在1 999～2 001 bp，編碼有兩個大的開放閱讀框（Open reading frame,ORF）：位于基因組左側(cè)的ORF1 編碼病毒復制相關蛋白（Rep）和位于病毒基因組右側(cè)的ORF2 編碼病毒抗原相關蛋白（Cap）[17-18]。序列分析比較發(fā)現(xiàn)，不同PCV3 來源Rep 蛋白和圓環(huán)病毒屬其他病原該基因同源性均較低，和蝙蝠源圓環(huán)病毒（Bat circovirus）最高，約為54%～55%，和PCV2 的氨基酸同源性僅為48%左右。研究還進一步發(fā)現(xiàn)，PCV3的Rep 蛋白上有3 個和病毒滾環(huán)復制相關的結構域：FTINN、HLQG 和YCKK[3-4]?！颈狙芯壳腥朦c】以PCV3 中的Rep 基因建立特異性檢測方法具有一定實用性和可行性?！緮M解決的關鍵問題】本研究通過分析PCV3 福建株Rep 基因特征，建立特異性檢測PCV3核酸感染的TaqMan 實時熒光定量PCR 方法，為后續(xù)開展Rep 基因在PCV3 復制和感染過程中的作用機制提供研究手段。

1 材料與方法

1.1 試驗毒株

PCV1、PCV2、豬細小病毒（Porcine parvovirus，PPV）、豬偽狂犬病毒（Porcine pseudorabies virus,PRV）、變異型豬偽狂犬病毒（Porcine pseudorabies virus variants, v-PRV）[19]、豬巨細胞病毒（Porcine cytomegalovirus, PCMV）[20]由福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所豬病研究室分離、鑒定和保存。

PCV3（FJ2017 株）、豬博卡病毒（Porcine bocavirus,PBoV）[21]、豬細環(huán)病毒1a 型（Porcine Torque teno sus virus type 1a, PTTSuV 1a）和豬細環(huán)病毒1b 型（Porcine Torque teno sus virus type 1b, PTTSuV 1b）[22-23]陽性病料均由福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所豬病研究室鑒定和保存。

1.2 主要儀器和試劑

實時熒光定量試劑FastFire qPCR PreMix（Probe）（FP208）、 PCR 擴 增 試 劑2×Taq PCR MasterMixⅡ、病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、快速質(zhì)粒小提試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司；pMD 18-T、DL2000 Marker 均購自寶生物工程大連有限公司；其他試劑均為商業(yè)公司購買的分析純。

1.3 PCV3 Rep 基因的克隆和陽性標準品的建立

按照病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒說明書操作，提取PCV3（FJ2017 株）的核酸DNA，利用針對Rep 基因的特異性引物進行擴增獲得PCV3 完整的Rep基因全長。上游引物PCV3-Rep-F1：5′-GTCCGGA、GGGAAAGCCCGAAAC-3′和下游引物PCV3-Rep-R1：5′- TCAATAGTTTATTGGATACACTGT-3′，預期擴增長度為891 bp。PCR 擴增體系配置如下（40 μL反應體系）：2×Taq PCR MasterMix Ⅱ反應液20 μL、上游引物（PCV3-Rep-F1，10 μmol·mL-1）和下游引物（PCV3-Rep-R1，10 μm·mL-1）均1 μL、提取的核酸DNA 模板2 μL，補充滅菌去離子水至終體積40 μL。PCR 擴增反應條件：94 ℃ 3 min 后進行PCR 循環(huán)（共進行35 個循環(huán)），條件為94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 55 s。PCR 循環(huán)結束后，72 ℃延伸10 min。對目的片段使用普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒切膠回收后克隆到pMD18-T 克隆載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞后，隨機選取8 個克隆利用快速質(zhì)粒小提試劑盒提取相應的質(zhì)粒進行鑒定。經(jīng)序列測定驗證BLAST 分析后，將符合預期的質(zhì)粒作為本試驗的陽性標準品質(zhì)粒（記為PCV3-Rep）。將獲得的陽性標準品用超微量紫外可見分光光度計對陽性質(zhì)粒進行定量，計算拷貝數(shù)并進行10 倍連續(xù)稀釋（濃度分別為4.22×107～4.22×100拷貝·μL-1），置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基于TaqMan 探針檢測PCV3 實時熒光定量PCR 方法的建立

1.4.1 特異性引物和探針的設計 將PCV3（FJ2017株）的Rep 基因序列和GenBank 中登錄的PCV3 其他毒株的相關基因序列分析比較，選取保守區(qū)作為特異性的引物和探針的設計區(qū)域。利用引物設計軟件Oligo v7.37 進行引物和探針設計，上游引物TaqMan-PCV3-F：5′-GGTGGGATGGTTATAATG-3′、下游引物TaqMan-PCV3-R：5′-TAGCCACAAAATTAAC AAAC-3′、探針引物TaqMan-PCV3-P：5′-CACCCTTAACAGGAACCCTCAGA-3′，其中5′端以FAM 標記，3′端Eclipse 標記。預期擴增長度為141 bp，上述引物和探針均在寶生物工程大連有限公司合成。

1.4.2 反應體系的建立和條件優(yōu)化 采用FastFire qPCR PreMix（Probe）推 薦 的25 μL 配 置TaqMan 實時熒光定量PCR 方法的反應液。以出現(xiàn)最高的熒光值（ΔRn）、最小的Ct 值為指標，對退火溫度（54～64 ℃）、不同引物終濃度（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μmol·L-1）和不同探針終濃度（0.05、0.1、0.25、0.50 μmol·L-1）進 行 條 件 優(yōu) 化，同 時 設NTC（No template control）對照。

1.4.3 標準曲線建立 以連續(xù)10 倍系列稀釋（濃度分別為4.22×107～4.22×100拷貝·μL-1）的標準品質(zhì)粒（PCV3-Rep）為模板，以1.4.2 優(yōu)化條件進行擴增，獲得擴增動力學曲線。以陽性標準品（PCV3-Rep）拷貝數(shù)的常用對數(shù)為橫坐標，以循環(huán)閾值（Ct 值）為縱坐標，計算出建立的TaqMan 實時熒光定量PCR方法的標準曲線，獲得本方法的標準線性回歸方程。

1.4.4 特異性檢測 用病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒提取PCV1、PCV2、PPV、PRV、v-PRV、PCMV、PBoV、PTTSuV 1a 和PTTSuV 1b 的基因組DNA，經(jīng)超微量紫外可見分光光度計進行定量后作為特異性檢測試驗對照。以1.4.2 優(yōu)化條件分別檢測PCV1、PCV2、PPV、PRV、v-PRV、PCMV、PBoV、PTTSuV 1a 和PTTSuV 1b 提取的核酸DNA，以標準品質(zhì)粒（PCV3-Rep）為陽性對照，以滅菌去離子水為陰性對照，評價建立的TaqMan 實時熒光定量PCR 方法的特異性。

1.4.5 變異系數(shù)測定 將陽性標準品質(zhì)粒（PCV3-Rep）設3 個重復（含量分別為4.22×105、4.22×103和4.22×101拷貝·μL-1），用建立的基于TaqMan 實時熒光定量PCR 方法進行特異性檢測，計算組內(nèi)（Intra-group）變異系數(shù)。將該標準陽性標準質(zhì)粒置于-20 ℃冰箱保存，每隔兩周重檢一次，連續(xù)檢測3 次，計算其組間（Inter-group）變異系數(shù)。

1.5 臨床樣品檢測

對本研究室保存于-70 ℃冰箱的193 份2014-2018 年收集的來自福建省多地市的豬臨床組織樣品，經(jīng)病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒提取相應的核酸DNA 后，利用建立的基于TaqMan 實時熒光定量PCR 方法進行PCV3 感染的特異性檢測。為明確相關樣品中PCV2 的感染情況，本研究同時對這193份樣品，利用前期建立的PCV2 特異性TaqMan 實時熒光定量PCR 方法進行平行檢測[24]。

2 結果與分析

2.1 Rep 基因的序列分析

本研究克隆獲得的PCV3（FJ2017 株）Rep 基因全長為891 bp，編碼完整的296 個氨基酸（aa），其等電點（Isolectric point）為8.752，GenBank 登錄號為MF072716。核苷酸同源性分析發(fā)現(xiàn)，不同PCV3來源Rep 基因同源性均較高，在99.6%～100%。將其和GenBank 中的PCV3 其他代表株進行遺傳進化分析，采用MEGA7 軟件，繪制遺傳進化樹采用NJ 法（Neighbor-Joining Methods），計算1 000 次重復（Bootstrap=1 000）。結果可見，不同地區(qū)、不同來源和不同分離時間PCV3 代表株Rep 基因相互之間較保守（圖1）。

2.2 實時熒光定量PCR 檢測方法的反應條件和反應體系

優(yōu)化的TaqMan 實時熒光定量PCR 檢測條件：98 ℃ 30 s 后進行循環(huán)，95 ℃ 5 s、 60 ℃ 15 s，進行40 個循環(huán)。優(yōu)化出的25 μL 最佳反應體系為體系：2×FastFire qPCR PreMix（2×）12.5 μL、 上/下 游引物（10 μmol·L-1）各0.75 μL、探針（10 μmol·L-1）0.5 μL、陽性標準品稀釋液2 μL、補水至終體積25 μL。

2.3 實時熒光定量PCR 檢測方法的擴增曲線和標準曲線

TaqMan 實時熒光定量PCR 方法檢測Rep 基因為4.22×101～4.22×106拷貝·μL-1有很好的線性關系，檢測的最低值為42.2 拷貝·μL-1（圖2）。所獲得標準曲線斜率（slope）為-3.413，Y 軸截距（Yintercept）為38.39，相關系數(shù)（R2）為0.999（圖3）。

2.4 實時熒光定量PCR 檢測方法的特異性

本研究建立的TaqMan 實時熒光定量PCR 僅對PCV3 檢測出現(xiàn)陽性擴增信號，對豬群其他常見病原（例如PCV1、PCV2、PPV、PRV、v-PRV、PCMV、PBoV、PTTSuV 1a 和PTTSuV 1b）檢測均為陰性（圖4）。

2.5 實時熒光定量PCR 檢測方法的變異系數(shù)

本研究建立的基于TaqMan 實時熒光定量PCR方法檢測PCV3 組內(nèi)變異系數(shù)為0.58%～1.10%；建立的方法的組間變異系數(shù)0.82%～1.48%（表1）。

2.6 臨床樣品檢測結果

對193 份樣品進行PCV3 和PCV2 感染的實時熒光定量PCR 檢測（表2），其中PCV3 陽性樣品127份，陽性率為65.80%；PCV2 陽性樣品161 份，陽性率為83.42%；PCV3 和PCV2 混合感染樣品102 份，陽性率為52.85%。

圖1 PCV3 不同代表株Rep 基因遺傳進化分析Fig.1 Phylogenetic analysis based on Rep of PCV 3

圖2 實時熒光定量PCR 檢測方法的擴增曲線Fig.2 Amplification curve of RT-PCR

圖3 實時熒光定量PCR 檢測方法的標準曲線Fig.3 Standard curve of RT-PCR

圖4 實時熒光定量PCR 檢測方法的特異性Fig.4 Specificity of TaqMan RT-PCR method

表1 實時熒光定量PCR 方法的變異系數(shù)Table 1 Coefficients of variation （CV） of TaqMan RT-PCR between inter- and intra-groups

表2 臨床樣品的檢測Table 2 Detection on clinical samples by TaqMan RT-PCR method

3 討論

截至目前，PCV3 還未見成功分離培養(yǎng)的相關研究報道，這為研究PCV3 的致病機理帶來困擾。前期研究發(fā)現(xiàn)，在患有多種臨床癥狀的豬（包括野豬）群多臟器中均可檢測到較高的PCV3 核酸陽性率[25-27]。但是近期研究也證實在健康豬群中也可檢測到PCV3 陽性，這導致PCV3 對豬群的致病力和機制還存在一定爭議[28]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)PCV3 還可在死胎、精液和初乳中均可檢測到核酸陽性，上述證據(jù)表明PCV3 可以垂直傳播[29-30]，給PCV3 的科學防控帶來極大挑戰(zhàn)。

研究發(fā)現(xiàn)，雖然PCV3 最早于2015 年在美國發(fā)現(xiàn)，但是對早期保存的豬組織樣品進行檢測發(fā)現(xiàn)，瑞典豬群中1993 年、西班牙和中國豬群中1996 年組織樣品中均可檢測到PCV3 陽性，表明PCV3 在豬群中存在較長時間[31-32]，本研究在保存的2014 年組織樣品中也檢測到PCV3 感染陽性，進一步豐富了PCV3在我國的流行病學信息。對于PCV3 基因組進行分析發(fā)現(xiàn)，PCV3 不同時空各毒株相互之間核苷酸同源性較高（98.0%以上），表明PCV3 在遺傳進化上較為保守。

前期Han 等[33]建立的可同時檢測PDEV 和PCV3的SYBR I 實時熒光定量PCR 方法，其最低檢測限分別為34.6 拷貝·μL-1（檢測PDEV）和61.2 拷貝·μL-1（檢測PCV3）。Kim 等[34]建立的可同時檢測PCV2和PCV3 的SYBR I 實時熒光定量PCR 方法，其最低檢測限均為50 拷貝·μL-1。本研究利用GenBank 數(shù)據(jù)庫PCV3 基因特點，選取其復制相關蛋白Rep 基因為候選基因靶區(qū)來設計特異性的引物和探針，建立檢測PCV3 感染的TaqMan 實時熒光定量PCR 方法，該方法敏感性好，最低檢測限為42.2 拷貝·μL-1，比Chen 等[27]建立實時熒光定量PCR 方法高，與Han等[33]和Kim 等[34]等建立的方法靈敏度相當；特異性強，對常見豬群傳染病均無交叉反應；建立的方法組內(nèi)變異系數(shù)和組間變異系數(shù)均在1.48%以內(nèi)。對福建2014-2018 年保存的193 份組織樣品進行檢測發(fā)現(xiàn)，PCV3 在福建省豬群中存在較高的陽性感染率（65.80%）。進一步對相關樣品進行PCV2 檢測發(fā)現(xiàn)，福建省豬群中存在極高的PCV3 和PCV2 混合感染，這提示我們需進一步開展PCV3 和PCV2 混合感染的致病機制和協(xié)調(diào)感染相關研究。