周利，姚苗苗，匡兵，高靜思，朱佳

1. 青島理工大學環(huán)境與市政工程學院，青島 266033

2. 山東省調(diào)水工程運行維護中心青島分中心，青島 266033

3. 哈爾濱工業(yè)大學深圳研究生院，深圳 518055

4. 深圳職業(yè)技術(shù)學院建筑與環(huán)境工程學院，深圳 518055

0 前言

水體富營養(yǎng)化已經(jīng)成為嚴重的水環(huán)境問題之一，2012年Tian等[1]在研究中國的南四湖時發(fā)現(xiàn)偽魚腥藻(Pseudanabaenasp.)為優(yōu)勢種，占比高達 32.94%，之后在中國的東平湖[2]，豐慶湖[3]等均發(fā)現(xiàn)偽魚腥藻占優(yōu)勢。偽魚腥藻屬于藍藻門，常見于淡水魚蝦池和水庫中[4-7]，一般作為微囊藻的伴生種一起在富營養(yǎng)化水體中形成水華[8]。可產(chǎn)生典型嗅味物質(zhì) 2-甲基異莰醇(2-MIB)[9-10]，Teneva等[11]證實了它還可以產(chǎn)生神經(jīng)毒素和肝毒素，需要引起足夠的關(guān)注和重視。

化感作用是植物產(chǎn)生的次代謝物質(zhì)進入到環(huán)境中從而對生物的生長產(chǎn)生作用[12]?；幸衷逵捎诰邆渖锝到庑院?、不污染環(huán)境，經(jīng)濟等特點，被認為是一種頗有前景的控藻方式[13-14]。近年來，關(guān)于化感作用在水生生態(tài)系統(tǒng)中的研究十分活躍，也發(fā)現(xiàn)了多種能夠抑制藻類生長的水生植物，如菖蒲(Acorus calamus L.)、梭魚草(Pontederia cordata)、南美蟛蜞菊(Wedelia trilobata)、美人蕉(Canna indica)[15-18]等。香菇草(Hydrocotyle vulgaris)也被證實化感作用明顯[19]，朱嘉成[20]2014年發(fā)現(xiàn)香菇草對銅綠微囊藻有明顯的化感抑制作用，但關(guān)于香菇草對偽魚腥藻化感作用的研究還未見報道。香菇草是傘形科(Umbelliferae)天胡荽屬(Hydrocotyle)多年生草本，原產(chǎn)于歐美的挺水或濕生觀賞植物，國內(nèi)多用做觀賞植物[21]，多分枝，節(jié)生根且根莖發(fā)達[22]，對環(huán)境適應(yīng)性強，生物量大[19]，具有良好的應(yīng)用前景。本文通過設(shè)置不同的香菇草根部浸提液的投加量，來研究香菇草根部浸提液對偽魚腥藻的化感作用，以期為防控偽魚腥藻提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗植物香菇草來自于深圳市南山花卉世界，長勢均勻，生長良好，無病蟲害，植株高約 10—20 cm，購買后將香菇草用自來水沖洗干凈，置于無菌玻璃瓶中，用 BG11培養(yǎng)基培養(yǎng) 2天，排除外界條件對試驗的干擾。試驗所需偽魚腥藻(FACHB-1277)購自中科院水生生物研究所淡水藻種庫。試驗正式開始前將偽魚腥藻藻種擴大培養(yǎng)至對數(shù)增長期，并反復(fù)接種擴大培養(yǎng)，待藻種數(shù)量達到試驗用量后接種試驗。試驗所用培養(yǎng)基為BG11培養(yǎng)基，經(jīng)高溫高壓滅菌后使用。

1.2 試驗方法

浸提液的制備:將新鮮的香菇草根部分離后，取100 g 于60 ℃下干燥48 h后研磨成粉末，然后用500 mL的 BG11培養(yǎng)基浸泡 48 h，離心去除殘渣，上清液先用定量濾紙過濾，再經(jīng)孔徑為0.2 μm 濾膜減壓抽濾排除微生物的影響，所得濾液即為浸提液母液，其香菇草根部浸提液濃度為200 g·L-1(以香菇草根部鮮重計)，置于冰箱(4 ℃)中貯存?zhèn)溆谩?/p>

試驗設(shè)置:在無菌條件下將香菇草根部浸提液、藻種置于500 mL錐形瓶內(nèi)，加入BG11 培養(yǎng)基使培養(yǎng)體系總體積為 250 mL，藻葉綠素 a濃度為 90 μg·L-1，香菇草根部浸提液添加量分別為 0、2 g·L-1，4 g·L-1，6 g·L-1，8 g·L-1、10 g·L-1(以香菇草根部鮮重計)共6個處理組，每組設(shè)三個平行。

培養(yǎng)條件: 試驗在光照培養(yǎng)箱中進行，光照強度2500 lx，光暗比 12 h:12 h，溫度 25 ℃，每天定時手動搖瓶3次，并任意交換錐形瓶位置，以減少由于培養(yǎng)箱內(nèi)光照不均勻而產(chǎn)生的試驗誤差。試驗所用所有玻璃器皿均經(jīng)121 ℃，20 min高溫滅菌后使用。

1.3 檢測儀器及檢測參數(shù)

試驗期間，采用調(diào)制熒光儀(PHYTO-PAM，Walz 公司，德國)檢測偽魚腥藻的ρ(Chl a)及藻細胞PSⅡ(光合系統(tǒng)Ⅱ)的光合活性。采用分光光度計及相關(guān)試劑盒(A001-1 南京建成生物工程研究所)測定SOD活性。

表1 香菇草根部浸提液濃度Table 1 The concentration gradient of water extract of Hydrocotyle vulgaris root

測定葉綠素熒光參數(shù)前將樣品暗適應(yīng)5 min，各參數(shù)可在儀器上直接讀出。PS Ⅱ光合活性的參數(shù): 1.Fv/Fm表示最大光化學量子產(chǎn)量，在光抑制條件下，F(xiàn)v/Fm的降低表明藻類受到了環(huán)境的脅迫。2.rETR為光抑制時的相對電子傳遞速率，相當于一定光強下單位生物量內(nèi)的光合作用速率。以葉綠素a的濃度〔ρ(Chl a)〕來反映藻細胞密度，采用特征熒光法測定ρ(Chl a)，即每天定時采用調(diào)制熒光儀直接測定，該方法便捷高效。

1.4 數(shù)據(jù)處理

香菇草根部浸提液對藻類的抑制率計算:IR=(1-N/N0)×100，式中:IR為抑制率%；N, N0分別為試驗組和對照組ρ(Chl a)，μg·L-1。

藻的比生長速率計算:μ= (lnX2-lnX1) /(T2-T1)，式中T1、T2為培養(yǎng)時間，X1、X2為培養(yǎng)T1、T2時間的偽魚腥藻ρ(Chl a)，μg·L-1。

EC50值是藻細胞生長抑制率為 50%時香菇草根部浸提液的濃度。以藻類ρ(Chl a)的變化作為衡量藻類活力的毒理響應(yīng)指標，香菇草浸提液濃度取10的對數(shù)為橫坐標，通過查生物統(tǒng)計機率值換算表，以ρ(Chl a)抑制率對應(yīng)的機率值作為縱坐標，求出回歸方程，以抑制率為 50%時對應(yīng)的機率值求出EC50的值[23]。

利用 Microsoft Excel 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同香菇草根部浸提液濃度對偽魚腥藻葉綠素a濃度的影響

偽魚腥藻與不同濃度的香菇草根部浸提液共培養(yǎng)22天后有不同程度的生長。由圖1可見，在前4天，各試驗組處于穩(wěn)定期，第 4—10天各試驗組出現(xiàn)緩慢增長，第 10天之后均進入了對數(shù)增長期，且各試驗組偽魚腥藻生長出現(xiàn)了較為明顯的差距。添加低濃度香菇草根部浸提液(2 g·L-1，4 g·L-1)的試驗組和對照組偽魚腥藻ρ(Chl a)數(shù)值區(qū)別不大，且趨勢相近，促進和抑制效果均不明顯。添加高濃度香菇草浸提液(6 g·L-1，8 g·L-1，10 g·L-1)的試驗組偽魚腥藻的生長則出現(xiàn)不同程度的抑制作用。培養(yǎng)結(jié)束時添加量為 0，2 g·L-1，4 g·L-1，6 g·L-1，8 g·L-1和 10 g·L-1的試驗組ρ(Chl a)分別為 7171.18 μg·L-1，6727.15 μg·L-1，6942.45 μg·L-1，4873.97 μg·L-1，3357.73 μg·L-1和 2437.08 μg·L-1。

各試驗組應(yīng)用ρ(Chl a)計算得到的藻類生長比增長速率如圖2所示。將添加量按照偽魚腥藻比增長速率從高到低排列依次為: 0，4 g·L-1，2 g·L-1，6 g·L-1，8 g·L-1和 10 g·L-1。最高比增長速率為 0.187 d-1，最低比增長速率為 0.143 d-1。

由圖3可見，各試驗組ρ(Chl a)抑制率差異顯著，10 g·L-1添加量組最高，其次是 8 g·L-1和 6 g·L-1，最后為 2 g·L-1和 4 g·L-1。低濃度組(2 g·L-1和 4 g·L-1)在培養(yǎng)期內(nèi)出現(xiàn)了促進藻細胞葉綠素a增長的現(xiàn)象。吳湘等[24]在研究黃花水龍對銅綠微囊藻化感作用時也發(fā)現(xiàn)低濃度組的化感物質(zhì)在試驗開始 1—2 d 內(nèi)對藻細胞生長反而起促進作用，肖晗等[25]也發(fā)現(xiàn)低濃度海菖蒲浸提液對錐狀斯氏藻起促進作用。添加量2 g·L-1組IR變化在-11.98%—9.88%之間，添加量4g·L-1組IR變化在-10.92%—8.60%之間，因此低濃度添加量組整體對藻葉綠素a作用效果不明顯。高濃度處理組(6 g·L-1，8 g·L-1和 10 g·L-1)在培養(yǎng)期一直表現(xiàn)為抑制，最后一天抑制出現(xiàn)了下降趨勢。最高抑制率為 73.43%(添加量 10 g·L-1，第 8 天時)。

圖1 不同香菇草根部浸提液濃度下偽魚腥藻葉綠素a的濃度Figure 1 The ρ(Chl a) of Pseudanabaena sp. under different concentrations of water extract of Hydrocotyle vulgaris root

圖2 第22天時不同香菇草根部浸提液濃度下偽魚腥藻的比生長速率Figure 2 Specific growth rates of Pseudanabaena sp. under different concentrations of water extract of Hydrocotyle vulgaris root on the 22 day

圖3 不同香菇草根部浸提液濃度下偽魚腥藻的葉綠素a抑制率Figure 3 The ρ(Chl a) inhibition rates of Pseudanabaena sp.under different concentrations of water extract of Hydrocotyle vulgaris root

2.2 不同香菇草根部浸提液濃度對偽魚腥藻葉綠素熒光參數(shù)的影響

圖4為不同香菇草根部浸提液濃度下偽魚腥藻最大光化學量子產(chǎn)量Fv/Fm的變化?？梢钥闯鯢v/Fm總體上呈先上升后下降的趨勢，添加量為 4 g·L-1，6 g·L-1，8 g·L-1，10 g·L-1的試驗組Fv/Fm值在第三天達到了峰值，10 g·L-1的值最大為 0.38，說明在初始階段，香菇草根部浸提液對偽魚腥藻有刺激作用，使得偽魚腥藻最大光化學量子產(chǎn)量產(chǎn)生快速的變動，之后由于藻自身的調(diào)節(jié)系統(tǒng)趨于穩(wěn)定。各組在第五天之后整體呈下降趨勢，對照組的下降趨勢最為緩慢，在第 13 天之后Fv/Fm值始終高于其他試驗組，整個培養(yǎng)期Fv/Fm變化范圍0.23—0.32。添加量為 2 g·L-1，4 g·L-1和 6 g·L-1三組Fv/Fm變化趨勢較為相似，在 11天之后Fv/Fm值低于對照組，大于添加量8 g·L-1，10 g·L-1的試驗組。添加量8 g·L-1，10 g·L-1試驗組的下降趨勢最大，第 7天之后，添加量為8 g·L-1的試驗組Fv/Fm始終大于添加量為10 g·L-1的試驗組，添加量為8 g·L-1試驗組的Fv/Fm變化范圍為 0.35—0.12，添加量為 10 g·L-1試驗組的Fv/Fm變化范圍 0.38—0.08。結(jié)合圖 5，10 g·L-1添加量下0—14天Fv/Fm抑制率穩(wěn)步上升，14天之后穩(wěn)定在40%左右，而最大抑制率為44.44%。

圖4 香菇草根部浸提液對偽魚腥藻最大光化學量子產(chǎn)量的影響Figure 4 The effects of water extract of Hydrocotyle vulgaris root on Fv/Fm of Pseudanabaena sp.

圖5 10 g·L-1香菇草根部浸提液濃度下偽魚腥藻最大光化學量子產(chǎn)量抑制率Figure 5 Inhibition rates of the Fv/Fm of Pseudanabaena sp. under 10 g·L-1 water extract of Hydrocotyle vulgaris root

不同香菇草根部浸提液濃度下偽魚腥藻最大相對電子傳遞速率rETR如圖6所示，與Fv/Fm變化趨勢相似。對照組偽魚腥藻最大相對電子傳遞速率數(shù)值在 72—86.7之間上下波動，整體較為平穩(wěn)?；形镔|(zhì)添加量為 2 g·L-1，4 g·L-1和 6 g·L-1的試驗組rETR值變化趨勢基本一致且數(shù)值差別不大，且第 5天之后，數(shù)據(jù)都低于對照組。添加量為 8 g·L-1，10 g·L-1的試驗組偽魚腥藻的下降趨勢最大，第6天之后，添加量為 8 g·L-1的試驗組rETR始終大于添加量為 10 g·L-1的試驗組，添加量為 8 g·L-1試驗組的rETR變化范圍為59—87.3，添加量為10 g·L-1試驗組的rETR變化范圍52—86.1。由圖7可以看出，添加量為10g·L-1抑制率隨時間延長波動上升，最后穩(wěn)定在20%上下，最大抑制率可達到28.63%。

2.3 不同香菇草根部浸提液濃度對偽魚腥藻酶活性的影響

圖6 香菇草根部浸提液對偽魚腥藻電子相對傳遞速率的影響Figure 6 The effects of water extract of Hydrocotyle vulgaris root on rETR of Pseudanabaena sp.

圖7 10 g·L-1香菇草根部浸提液濃度下偽魚腥藻電子相對傳遞速率抑制率Figure 7 Inhibition rates of the rETR of Pseudanabaena sp.under 10 g·L-1 water extract of Hydrocotyle vulgaris root

圖8 第 13天時不同香菇草根部浸提液濃度下偽魚腥藻SOD活性Figure 8 The SOD activities of Pseudanabaena sp. under different concentrations of water extract of Hydrocotyle vulgaris root on the 13th day

圖8為試驗第13天時不同香菇草根部浸提液添加量下偽魚腥藻SOD活性?？梢钥闯龈髟囼灲MSOD活性都大于對照組，且添加量越高，SOD升高越大。添加量為 10 g·L-1的試驗組 SOD 值為 6.627 U·mg-1，遠大于對照組SOD值0.623 U·mg-1，說明藻細胞生長受到了外界極大脅迫。

3 討論

化感作用的抑藻機理主要是破壞藻細胞的結(jié)構(gòu)，改變光合作用，影響生物體酶的活性，改變核酸代謝等[12]。本研究結(jié)果表明，香菇草根部浸提液濃度從6 g·L-1的試驗組開始對偽魚腥藻產(chǎn)生持續(xù)明顯的化感抑制效果，(EC50，96h)值為 9.33 g·L-1。李慶華等[26]研究柳樹葉浸提液化感抑藻效應(yīng)，結(jié)果表明對蛋白核小球藻有顯著的化感抑制作用，半效應(yīng)濃度(EC50，96h) 值為 11.82 g·L-1，白羽等[27]研究發(fā)現(xiàn)加拿大一枝花對銅綠微囊藻具有化感抑制作用，(EC50，72h)值為 9.57 g·L-1，表明香菇草根部浸提液具有抑制水華藍藻的潛能，在篩選植物來化感抑制藻類水華方面值得引起關(guān)注。

在整個培養(yǎng)周期內(nèi)低濃度的香菇草根部浸提液組(2 g·L-1，4 g·L-1)對偽魚腥藻ρ(Chl a)的促進或抑制 效 果 不 明 顯 ，而 高 濃 度 添 加 量 組 (6 g·L-1，8 g·L-1，10 g·L-1)ρ(Chl a)顯著低于對照組，最高抑制率可達 73.43%(添加量 10 g·L-1，第 8 天時)。有報道稱附著在鳳眼蓮根部的藻細胞中葉綠素a 濃度明顯下降，而它的降解產(chǎn)物脫鎂葉綠素 a酸酯的含量顯著升高，表明鳳眼蓮抑藻成分可能促進了葉綠素 a的降解[28]。由此推測高濃度的香菇草根部浸提液可能促進藻類葉綠a的降解，減少藻類的同化產(chǎn)物，進而抑制偽魚腥藻的生長。添加量為6 g·L-1，8 g·L-1和10 g·L-1組在培養(yǎng)到第22天偽魚腥藻葉綠素a抑制率明顯低于第16天時，造成這種現(xiàn)象的原因有可能是香菇草的抑藻成分不穩(wěn)定，易分解或者具有揮發(fā)性，亦或是抑藻成分被藻細胞吸收。添加量為 6 g·L-1，8 g·L-1和 10 g·L-1組比生長速率分別為 0.173 d-1，0.158 d-1和0.143 d-1?？梢婋S著香菇草根部浸提液濃度的增加，其抑藻效果逐漸增強。

在整個培養(yǎng)周期加入化感物質(zhì)的試驗組，F(xiàn)v/Fm，rETR整體都低于對照組，可以推測，香菇草根部浸提液會影響藻類的光合系統(tǒng)，降低光合系統(tǒng)的最大光化學量子產(chǎn)量和相對電子傳遞速率，進而達到降低生物量的效果。杜彩麗等[29]研究發(fā)現(xiàn)高濃度的蟛蜞菊水提液嚴重破壞了藻細胞內(nèi)部的類囊體膜和氣囊等結(jié)構(gòu)，類囊體膜的溶解會導(dǎo)致葉綠素和藻膽體等光合色素失去載體，氣囊的破壞將造成細胞沉降，不利于光合作用。這可能是造成高濃度香菇草根部浸提液下偽魚腥藻最大光化學量子產(chǎn)量和相對電子傳遞速率明顯減小的原因。添加量10 g·L-1的Fv/Fm和rETR值顯著低于對照組，且數(shù)值最低，與葉綠素a結(jié)果一致。說明10 g·L-1試驗組偽魚腥藻受到外界的威脅最大。高濃度組(6 g·L-1，8 g·L-1和 10 g·L-1)偽魚腥藻葉綠素熒光參數(shù)都小于對照組，藻類的光合速率減弱，推測香菇草根部浸提液通過降低藻的光合速率來達到化感抑藻的效果。Fv/Fm最大抑制率為 44.44%(添加量為 10 g·L-1，第 16 天時)，rETR最大抑制率為28.68%(添加量為10 g·L-1，第20天時)，可能化感作用對Fv/Fm的抑制效果強于rETR。

本試驗研究中，SOD的活性隨著香菇草根部浸提液添加量的增多而應(yīng)激性增加，表明香菇草根部浸提液添加量越多，偽魚腥藻受到的威脅越大，化感作用越強。低濃度(2 g·L-1，4 g·L-1)組 SOD 值較對照組略有上升，可見低濃度香菇草根部浸提液對偽魚腥藻有一定的脅迫致使一定量的氧自由基產(chǎn)生，但 SOD也隨之呈現(xiàn)一定的應(yīng)激活性來對抗與阻斷因氧自由基對細胞造成的損害，這可能是低濃度香菇草根部浸提液對偽魚腥藻化感作用不明顯的原因。當添加量上升到 6 g·L-1，8 g·L-1和 10 g·L-1時，SOD的活性大幅度升高，說明藻類已經(jīng)受到了較大的威脅，使細胞內(nèi)的氧自由基過量產(chǎn)生，雖然 SOD活性隨之上升，但機體本身的抗氧化體系已經(jīng)不能完成清除氧自由基，活性氧大量累積可造成植物細胞內(nèi)發(fā)生過氧化反應(yīng)，破壞細胞內(nèi)膜系統(tǒng)，使機體功能受損[30]，最終抑制偽魚腥藻生長，由此推測過藻細胞氧化損傷為香菇草根部浸提液的化感抑藻機理之一。

本研究發(fā)現(xiàn)添加量為 6 g·L-1，8 g·L-1和 10 g·L-1的香菇草根部浸提液對偽魚腥藻有化感抑制作用，表現(xiàn)為偽魚腥藻生物量的減少，藻光合系統(tǒng)受損以及對藻抗氧化體系酶有一定影響，其抑藻能力隨著香菇草根部浸提液添加量增多而增強，因此香菇草可作為一種潛在生態(tài)控藻生物，為控制偽魚腥藻水華發(fā)生提供一種新思路。需要說明的是，本試驗是在排除細菌作用，光照不勻，營養(yǎng)競爭等條件下進行的，與自然水體環(huán)境條件尚不能完全吻合，究竟香菇草根部浸提液在實際生態(tài)系統(tǒng)中對藻類的影響如何，還需進一步研究。