（閬中市人民醫(yī)院，四川 閬中 637400）

急性肝損傷（acute liver injury,ALI）是指肝臟疾病發(fā)展至功能衰竭的中間環(huán)節(jié)。我國是肝病高發(fā)國家，其中感染為主要病因，由此導(dǎo)致的脂多糖血癥是造成肝功能損傷的重要因素[1]。在疾病進(jìn)展中，內(nèi)毒素可使機(jī)體炎癥反應(yīng)失控，大量的炎癥因子和效應(yīng)細(xì)胞相互激活，引起肝細(xì)胞彌漫性壞死[2]。如果不能得到有效控制，可引發(fā)肝纖維化、肝硬化甚至是臟器衰竭危及患者生命，但目前ALI 的病理機(jī)制尚未完全闡明[3]。有學(xué)者報(bào)道肝損傷與高遷移率族蛋白B1（high modility groupbox 1,HMGB1）活化有關(guān)，HMGB1 能夠進(jìn)一步激活Toll 樣受體4（Toll like receptor4,TLR4）、核因子κB（nuclear factor kappaB,NF-κB）通路，通過大量釋放炎癥介質(zhì)，引起肝損傷[4]。有研究發(fā)現(xiàn)阻斷HMGB1 信號(hào)，能有效抑制四氯化碳誘導(dǎo)的肝損傷小鼠肝臟細(xì)胞凋亡[5]，但未有明確報(bào)道證明HMGB1/TLR4/NF-κB 信通路對(duì)脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）誘導(dǎo)大鼠ALI 的保護(hù)作用。作為常用中藥材，決明子具有清肝明目的功效，在臨床廣泛使用，有研究發(fā)現(xiàn)，決明子有效成分為蒽醌類化合物[6]。有研究顯示決明子總蒽醌通過對(duì)肝細(xì)胞增殖與凋亡的影響，促進(jìn)肝組織再生修復(fù)[7]。近期有學(xué)者報(bào)道決明子總蒽醌能夠抑制NF-κB 通路蛋白的表達(dá)，降低炎癥反應(yīng)[8]。本研究通過復(fù)制LPS 誘導(dǎo)的ALI 大鼠模型，探討決明子總蒽醌對(duì)大鼠肝臟的作用機(jī)制，為臨床提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF 級(jí)8 ～10 周齡的SD 雄性大鼠60 只，體重200 ～220 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011]。依照閬中市人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理辦法，室溫下標(biāo)準(zhǔn)飼料、自由飲水、分籠（4 籠）適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均經(jīng)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：2019-032）。

1.1.2 主要試劑LPS 購自美國Sigma 公司，決明子總蒽醌由本實(shí)驗(yàn)室提取（批號(hào)：20180624），BCA 蛋白測(cè)定試劑盒、DAB 化學(xué)發(fā)光試劑盒購自南京建成生物有限公司，HMGB1、TLR4 及NF-κB 抗體購自德國Rebstock 公司，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α,TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（Interleukin 6,IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（Interleukin 1β,IL-1β）試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器LIOOS600T 生物顯微鏡購自日本尼康公司，凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad 公司，-80℃超低溫冰箱購自德國維根斯公司，RM2135 組織切片機(jī)購自德國Leica 公司，高速低溫離心機(jī)購自北京六一儀器廠。

1.2 模型復(fù)制和分組

大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組12 只。除對(duì)照組外其余各組大鼠尾部靜脈注射5 mg/kg LPS 復(fù)制ALI 模型，注射劑量0.5 ml；對(duì)照組給予同等體積的生理鹽水[9]。低、中、高劑量組大鼠在模型復(fù)制后每日分別給予灌胃1 次10 mg/kg、20 mg/kg 及40 mg/kg的決明子總蒽醌，灌胃劑量5 ml，連續(xù)給藥14 d；對(duì)照組和模型組給予等體積生理鹽水。

1.3 血清生化指標(biāo)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)第15 天清晨抽取大鼠空腹尾部靜脈血，4℃、5 000 r/min 離心10 min，取上層血清，4 h 內(nèi)采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)各組大鼠肝功能指標(biāo)，包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransfease,ALT）、總膽紅素（total bilirubin,TBIL）及天門冬氨酸基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase,AST）。

1.4 HE 染色觀察肝組織病理變化

采血后引頸處死大鼠，沿腹中線切開腹壁，暴露腹腔組織，小心分離肝臟，采用10%多聚甲醛固定24 h 后切片，HE 染色后光鏡下觀察其病理改變。

1.5 TUNEL 染色檢測(cè)各組大鼠肝組織中的細(xì)胞凋亡

從冰箱中取出10%大鼠肝組織，常規(guī)方法固定，冷凍切片，二甲苯浸洗2 次，梯度酒精浸洗5 min，風(fēng)干后用3%雙氧水-甲醇浸泡10 min，PBS 漂洗3 次，3 min/次。采用4℃乙醇預(yù)冷的0.1% TritonX-100、0.1%緩沖液處理2 min，PBS 漂洗3 次，3 min/次，加入TUNEL 反應(yīng)混合液，加封口膜在暗濕盒中反應(yīng)1 h，溫度37℃。采用PBS 漂洗，二甲苯處理并用中性樹脂封片后，顯微鏡下觀察各組大肝細(xì)胞凋亡情況。

1.6 ELISA 檢測(cè)TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平

取肝臟組織并用勻漿器打碎，4℃、8 000 r/min離心15 min，收集上清液，采用ELISA 試劑盒檢測(cè)肝組織中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行，用酶標(biāo)儀記錄光密度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各因素水平。

1.7 Western blotting 檢測(cè)HMGB1、TLR4 及NF-κB蛋白

取大鼠部分肝組織，加入RIPA 組織裂解液，勻漿器打碎，4℃、8 000 r/min 離心10 min，取上清液提取總蛋白并定量。在蛋白樣品中加入上樣緩沖液，然后在95℃或更高溫度下變性10 min。將樣品加入SDS-PAGE 膠樣品孔中。膜轉(zhuǎn)移后用2% BSA 密封過夜。用TBST 清洗4 次后，在4℃條件下用一級(jí)抗體孵育過夜，TBST 清洗4 次后，將二級(jí)抗體在37℃條件下孵育1 h，TBST 清洗4 次，反應(yīng)30 s 后顯影，在成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光和圖像采集，并以GAPDH 作為內(nèi)參蛋白計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 決明子總蒽醌對(duì)ALI 大鼠肝功能的影響

各組ALT、AST 及TBIL 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組較對(duì)照組升高（P＜0.05），中、高劑量組較模型組下降（P＜0.05）。決明子總蒽醌對(duì)ALI 大鼠肝功能的保護(hù)具有劑量依賴性。見表1。

表1 各組ALT、AST 及TBIL 水平比較 （n=12，±s）

表1 各組ALT、AST 及TBIL 水平比較 （n=12，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P＜0.05，②與模型組比較，P＜0.05。

組別 ALT/（u/L） TBIL/（μmol/L） AST/（u/L）對(duì)照組 42.30±6.49 9.05±3.42 142.26±15.63模型組 240.68±9.27① 43.49±2.71① 343.55±16.54①低劑量組 234.12±7.59 41.92±2.32 340.46±14.63中劑量組 154.41±5.06② 24.40±3.25② 238.72±13.85②高劑量組 88.98±4.81② 14.51±3.01② 201.82±12.61②F 值 153.232 182.532 128.458 P 值 0.000 0.000 0.000

2.2 決明子總蒽醌對(duì)ALI 大鼠肝臟的影響

對(duì)照組大鼠肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，清晰可辨；細(xì)胞整齊排列，細(xì)胞間質(zhì)無水腫，肝臟橫紋清晰且規(guī)則。模型組大鼠肝臟細(xì)胞腫脹且排列不規(guī)則；細(xì)胞間質(zhì)水腫明顯及細(xì)胞外基質(zhì)增多，可見較多炎癥細(xì)胞浸潤，成纖維細(xì)胞增多。低劑量組大鼠肝臟細(xì)胞排列更加紊亂，部分核膜破裂、消失，可見部分細(xì)胞胞膜缺失，細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡狀態(tài)，肝臟細(xì)胞間質(zhì)充血嚴(yán)重，肝臟橫紋消失，出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤。與模型組相比，中、高劑量組大鼠肝臟細(xì)胞較模型組排列規(guī)則，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，肝臟細(xì)胞損傷癥狀明顯減輕，細(xì)胞凋亡狀態(tài)明顯改善，并呈劑量依賴性。見圖1。

2.3 決明子總蒽醌對(duì)ALI 大鼠肝臟細(xì)胞凋亡的影響

對(duì)照組、模型組、低劑量組、中劑量組及高劑量組肝細(xì)胞凋亡率分別為（12.76±1.39）%、（79.26±6.97）%、（75.51±4.22）%、（61.41±2.48）%和（47.87±8.29）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=56.384，P=0.000）；模型組較對(duì)照組升高（P＜0.05），中、高劑量組較模型組下降（P＜0.05）。決明子總蒽醌對(duì)ALI 大鼠肝細(xì)胞凋亡的抑制作用具有劑量依賴性。見圖2。

圖1 決明子總蒽醌對(duì)ALI 大鼠肝臟的影響 （HE×200）

圖2 決明子總蒽醌對(duì)ALI 大鼠肝臟細(xì)胞凋亡的影響 （TUNEL 染色×400）

2.4 決明子總蒽醌對(duì)ALI 大鼠IL-1β、IL-6 和TNF-α 的影響

各組肝組織中IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組較對(duì)照組升高（P＜0.05），中、高劑量組較模型組下降（P＜0.05）。決明子總蒽醌對(duì)ALI 大鼠肝臟炎癥因子水平的抑制作用具有劑量依賴性。見表2。

表2 各組肝組織中IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平比較 （n=12，pg/ml，±s）

表2 各組肝組織中IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平比較 （n=12，pg/ml，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P＜0.05，②與模型組比較，P＜0.05。

組別 IL-6 IL-1β TNF-α對(duì)照組 61.18±6.62 20.92±1.40 156.45±5.45模型組 336.61±14.29① 58.90±6.35① 632.16±14.57①低劑量組 330.68±4.14 55.49±3.79 623.37±10.02中劑量組 221.77±9.45② 41.92±4.00② 377.85±15.33②高劑量組 138.44±4.37② 32.26±4.13② 288.44±6.72②F 值 192.515 32.394 168.302 P 值 0.000 0.000 0.000

2.5 決明子總蒽醌對(duì)ALI 大鼠肝組織中HMGB1、TLR4 及NF-κB 蛋白表達(dá)的影響

各組肝組織中HMGB1、TLR4 及NF-κB 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組較對(duì)照組升高（P＜0.05），中、高劑量組較模型組下降（P＜0.05）。決明子總蒽醌對(duì)ALI 大鼠肝臟HMGB1、TLR4 及NF-κB 蛋白的調(diào)控作用具有劑量依賴性。見表3 和圖3。

表3 各組肝組織中HMGB1、TLR4 及NF-κB 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n=12，±s）

表3 各組肝組織中HMGB1、TLR4 及NF-κB 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n=12，±s）

注：①與對(duì)照組相比，P＜0.05，②與模型組相比，P＜0.05。

組別 HMGB1 TLR4 NF-κB對(duì)照組 0.96±0.08 0.97±0.07 0.98±0.07模型組 3.90±0.28① 4.60±0.13① 2.66±0.24①低劑量組 3.79±0.21 4.50±0.18 2.54±0.19中劑量組 2.89±0.33② 2.88±0.29② 1.98±0.23②高劑量組 2.32±0.18② 2.36±0.18② 1.58±0.10②F 值 20.482 23.434 13.523 P 值 0.002 0.000 0.003

圖3 肝組織中HMGB1、TLR4 及NF-κB 蛋白的表達(dá)

3 討論

ALI 可由多種因素引起，是以肝功能迅速惡化為臨床特點(diǎn)的急性綜合征，影響肝臟的解毒、生物轉(zhuǎn)化和排泄等功能，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)肝臟大面積壞死直至衰竭[10]。ALI 病死率較高，給患者家庭及社會(huì)造成沉重負(fù)擔(dān)，如何治療ALI 仍是臨床醫(yī)學(xué)中具有挑戰(zhàn)的課題之一。因此研究ALI 的發(fā)病機(jī)制，探索新的治療藥物和方法具有重要的臨床價(jià)值。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，決明子具有良好的抗炎、抗纖維化、降血壓、抗氧化等多種生物學(xué)功能[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，決明子總蒽醌能明顯降低免疫性肝損傷大鼠肝組織炎癥因子的表達(dá)水平[12]。MENG 等[13]研究證實(shí)，決明子總蒽醌能影響血清中CTGF 和TGF-β1的含量，改善慢性肝衰竭大鼠的肝功能。有報(bào)道稱，決明子總蒽醌能明顯抑制病毒感染大鼠的肝組織纖維化[14]。有學(xué)者通過構(gòu)建四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型發(fā)現(xiàn)，大鼠經(jīng)決明子總蒽醌治療后肝臟組織中凋亡蛋白水平降低，免疫系統(tǒng)被激活，炎癥細(xì)胞浸潤明顯好轉(zhuǎn)[15]。以上結(jié)果提示決明子總蒽醌對(duì)多種原因引起的肝細(xì)胞凋亡能起到保護(hù)作用。然而決明子總蒽醌在LPS 誘導(dǎo)ALI 中的研究目前少有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，模型組大鼠肝功能明顯降低，肝臟細(xì)胞腫脹變形，并可見較多炎癥細(xì)胞浸潤，肝臟組織細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯增多。經(jīng)過決明子總蒽醌處理后，與模型組相比，肝臟病理改變明顯，肝細(xì)胞凋亡受到明顯抑制，呈劑量依賴性。

有研究發(fā)現(xiàn)，ALI 伴有大量的炎癥細(xì)胞浸潤，肝上皮細(xì)胞通透性在逐級(jí)放大的炎癥反應(yīng)中增強(qiáng)，最終引起肝組織纖維化和肝水腫[16]。IL-1β、IL-6 和TNF-α 作為反映炎癥水平的重要因子，在誘導(dǎo)肝衰竭過程中發(fā)揮重要作用[17]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)決明子總蒽醌治療后的ALI 大鼠肝組織中IL-1β、IL-6和TNF-α 水平明顯降低。說明決明子總蒽醌可以有效降低LPS 誘導(dǎo)ALI 大鼠肝臟的炎癥水平。HMGB1、TLR4 及NF-κB 是與炎癥相關(guān)的重要信號(hào)通路，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)外周血中HMGB1 水平升高，會(huì)伴有炎癥癥狀加重，HMGB1 與炎癥介質(zhì)相互作用構(gòu)成免疫刺激復(fù)合物是促進(jìn)這一過程的重要機(jī)制[18]。另有文獻(xiàn)報(bào)道HMGB1 可通過TLR4 信號(hào)通路調(diào)控非酒精性肝損傷大鼠炎癥反應(yīng)，TLR4 在HMGB1 調(diào)控下，其下游磷酸化水平升高，進(jìn)而活化NF-κB，而NF-κB 蛋白與細(xì)胞炎癥反應(yīng)及其凋亡作用密切相關(guān)[19]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠HMGB1、TLR4 及NF-κB 蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高，中、高劑量組大鼠HMGB1、TLR4、NF-κB 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，提示決明子總蒽醌可能通過HMGBA 介導(dǎo)TLR4、NF-κB 通路，對(duì)LPS 誘導(dǎo)的ALI 發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，決明子總蒽醌可以抑制LPS 誘導(dǎo)ALI模型大鼠的HMGB1/TLR4/NF-κB 信號(hào)通路的激活，從而減輕對(duì)臟器的損害，改善肝功能。但決明子總蒽醌是否還能通過調(diào)節(jié)其他信號(hào)通路發(fā)揮作用，以及如何將決明子總蒽醌應(yīng)用于ALI 患者的臨床治療，仍需進(jìn)一步研究。