張立 李恒 張飛越 王書廷 李高峰

1 介紹

1.1 非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）免疫治療背景 癌癥免疫治療是指利用機(jī)體自身免疫系統(tǒng)的力量對抗癌癥的治療策略，包括免疫檢查點(diǎn)抑制劑療法、過繼免疫治療以及癌癥疫苗等。針對程序性死亡分子1（programmed death-1, PD1）及其配體（programmed death ligand 1, PD-L1）途徑的免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療晚期NSCLC表現(xiàn)可觀[1]。此外，其他潛在的免疫檢查點(diǎn)受體，如淋巴細(xì)胞活化基因3蛋白（lymphocyte-activation gene 3, LAG3）、T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白結(jié)構(gòu)域3（T cell immunoglobulin domain and mucin domain 3, TIM3）和殺傷性免疫球蛋白樣受體（killer immunologublin receptor,KIR）等相關(guān)研究也如火如荼的開展[2]。過繼性細(xì)胞免疫治療是指向腫瘤患者移注在體外擴(kuò)增和活化的免疫細(xì)胞，進(jìn)而通過直接殺傷腫瘤或激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)來殺傷腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療癌癥的目的。

1.2 CAR-T細(xì)胞療法治療NSCLC 嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞（Chimeric antigen receptor modified T cells, CAR-T cells）療法是發(fā)展最為迅速的一種過繼性細(xì)胞免疫治療。該療法是用基因工程合成受體轉(zhuǎn)導(dǎo)患者T細(xì)胞以靶向癌細(xì)胞表面抗原，以介導(dǎo)抗腫瘤作用。CAR-T細(xì)胞已經(jīng)被商業(yè)批準(zhǔn)用于治療白血病和淋巴瘤。在白血病和淋巴瘤患者中，如Tisagenlecleucel和axicabtagene ciloleucel這兩種已批準(zhǔn)的靶向CD19的嵌合抗原受體CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品在造血系統(tǒng)惡性腫瘤的治療中取得了顯著的療效[3-5]。如抗CD19 CAR-T細(xì)胞對B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病（B lineage acute lymphoblastic leukemia, B-ALL）的治療完全緩解率達(dá)到了90%[6]，這激發(fā)了越來越多的臨床試驗探索針對NSCLC在內(nèi)的實(shí)體瘤的CAR-T細(xì)胞療法（圖1）。

2 CAR-T治療NSCLC的靶標(biāo)選擇

CAR-T在包括NSCLC在內(nèi)的實(shí)體瘤要實(shí)現(xiàn)良好的成果轉(zhuǎn)化，合理選擇和利用靶標(biāo)是至關(guān)重要的第一步。良好的靶標(biāo)應(yīng)該具有較廣的覆蓋率和較強(qiáng)的特異性以及固定的表達(dá)。覆蓋率決定了CAR-T治療的上限，而特異性則會影響治療強(qiáng)度，靶標(biāo)丟失將導(dǎo)致CAR-T治療失敗。由于實(shí)體瘤的治療很難獲得如CD19類似的理想靶標(biāo)，因此，CAR-T療法的作用不應(yīng)僅限于直接殺死癌細(xì)胞，還有例如激活內(nèi)源性腫瘤免疫反應(yīng)和破壞腫瘤的生長環(huán)境等策略有待開發(fā)[7,8]。

2.1 靶向表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor, EGFR） 臨床上治療已經(jīng)開發(fā)出多種對NSCLC靶向治療的藥物。在一項I期臨床研究中，針對復(fù)發(fā)/難治性，經(jīng)基因檢測表皮生長因子受體（EGFR）陽性（＞50%表達(dá)）的NSCLC患者，在接受劑量遞增的靶向EGFR的EGFR-CAR-T細(xì)胞輸注治療后，在病理活檢患者中觀察到病理緩解，而且在腫瘤浸潤性T細(xì)胞中檢測到的CAR-EGFR基因。這表明EGFR-CAR-T細(xì)胞療法治療EGFR陽性晚期復(fù)發(fā)/難治性NSCLC是安全可行的[9]。還有研究通過優(yōu)化非病毒的piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，通過工程化人類T細(xì)胞以表達(dá)EGFR-CAR。修飾的CAR T細(xì)胞在體外具有擴(kuò)增能力和抗癌作用，以及在異種移植EGFR陽性肺癌患者腫瘤細(xì)胞的動物體內(nèi)引起腫瘤消退[10]。

除此之外，EGFR變體III（EGFRvIII）是一種在NSCLC中檢測到的突變率為10%的腫瘤特異性突變。EGFRvIII-CART通過表達(dá)和釋放包括穿孔素、顆粒酶B、干擾素γ（Interferon, IFN-γ）和腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor, TNF-α）在內(nèi)的細(xì)胞因子，特異且有效地識別和殺死EGFRvIII細(xì)胞。對體內(nèi)和體外表達(dá)EGFRvIII的肺癌細(xì)胞顯示出良好的抗腫瘤活性，這標(biāo)志著靶向EGFRvIII的CAR-T是預(yù)防肺癌術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的不可小覷的治療策略[11]。

2.2 靶向免疫檢查點(diǎn)CAR-T細(xì)胞

2.2.1 靶向CAR-T細(xì)胞中PD-1受體 CAR-T療法對于NSCLC的治療效果不理想與免疫抑制性腫瘤微環(huán)境有關(guān)。NSCLC中PD-L1的表達(dá)抑制CAR-T細(xì)胞的功效。CAR-T細(xì)胞與檢查點(diǎn)封鎖相結(jié)合的組合免疫療法策略是一種有前途的NSCLC治療方法。除PD-1外，在腫瘤微環(huán)境還存在其他免疫抑制機(jī)制，如T細(xì)胞上還表達(dá)了多種共抑制受體（例如TIM-3、LAG3和TIGIT）。因此同時靶向多種抑制途徑可能會進(jìn)一步增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞效力[12]。

2.2.2 通過工程化嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞以分泌檢查點(diǎn)抑制劑來增強(qiáng)癌癥免疫療法 有研究[13]設(shè)計了能分泌檢查點(diǎn)抑制劑的CAR-T細(xì)胞（CAR.αPD1-T），并評估了它們在人肺癌異種移植小鼠模型中的功效。CAR.αPD1-T細(xì)胞具有組成性抗PD-1分泌，在體外和體內(nèi)異種移植小鼠模型中，通過評價抗原特異性刺激后CAR.αPD1-T細(xì)胞的效應(yīng)功能和體外擴(kuò)增能力，包括IFNγ和T細(xì)胞增殖。確定了CAR.αPD1-T細(xì)胞分泌的人類抗PD-1 檢查點(diǎn)抑制劑與PD-1有效結(jié)合，并逆轉(zhuǎn)了PD-1/PD-L1相互作用對T細(xì)胞功能的抑制作用，抗PD-1的分泌增強(qiáng)了CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤活性并延長了總生存期。

2.3 NSCLC的其他靶標(biāo)

2.3.1 促紅細(xì)胞生成素A2（Erythropoietin A2, EphA2）EphA2在90%以上的NSCLC中過表達(dá)。因此它是NSCLC中CAR-T治療的潛在重要腫瘤抗原靶標(biāo)。具有針對EphA2的共刺激受體4-1BB的第二代CAR，在EphA2陽性NSCLC的異種移植小鼠模型中評估了體內(nèi)效果，EphA2-CAR-T細(xì)胞可通過產(chǎn)生細(xì)胞因子IFN-γ引起腫瘤細(xì)胞裂解。用EphA2-CAR-T細(xì)胞治療的小鼠的腫瘤信號呈下降趨勢，并且比未轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞治療的小鼠要低得多。這些結(jié)果表明EphA2-CAR-T細(xì)胞免疫療法可能是治療EphA2陽性NSCLC的一種策略[14]。

2.3.2 PSCA和MUC1 前列腺干細(xì)胞抗原（prostate stem cell antigen, PSCA）和黏蛋白1（muein1, MUC1）在NSCLC中的表達(dá)。有研究結(jié)果表明，在人類NSCLC的患者異種移植（patient-derived xenograft, PDX）保持原發(fā)性腫瘤的抗原特性小鼠模型中，靶向PSCA的CAR-T細(xì)胞可以抑制PDX小鼠中NSCLC腫瘤的生長，除此之外，與靶向MUC1的CAR-T細(xì)胞聯(lián)合使用甚至可以協(xié)同消除PSCA+MUC1+腫瘤。PSCA和MUC1都是NSCLC中有希望的CAR-T細(xì)胞靶標(biāo)，并且這些抗原的組合靶向可以進(jìn)一步增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤功效[15]。

圖 1 CAR-T免疫療法治療NSCLC。CAR-T細(xì)胞療法的主要步驟包括：①分離體內(nèi)的T細(xì)胞；②嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞（嵌合抗原受體CAR主要包括胞內(nèi)激活區(qū)和共刺激區(qū)域、跨膜區(qū)、胞外的鉸鏈區(qū)和抗原結(jié)合區(qū)）；③CAR-T細(xì)胞的體外擴(kuò)增；④CAR-T細(xì)胞回輸至體內(nèi)殺傷腫瘤細(xì)胞。Fig 1 CAR-T immunotherapy for NSCLC. The main steps of CAR-T cell therapy include: (1) isolating T cells in vivo; (2) modifying T cells with chimeric antigen receptor (CAR mainly includes intracellular activation area and co-stimulation area; transmembrane area; extracellular hinge area and antigen binding area); (3) expansion of CAR-T cells in vitro; (4) reinfusion of CAR-T cells to kill tumor cells in vivo. CAR-T: Chimeric antigen receptor modified T; NSCLC: non-small cell lung cancer; APC: antigen presenting cell; MHC: major histocompatibility complex.

2.3.3 靶向間皮素（mesothelin, MSLN）的MSLN-CAR-T細(xì)胞 MSLN在NSCLC中較正常組織表達(dá)豐富。針對MSLN的第二代結(jié)合了共刺激CD28和4-1BB信號域以增強(qiáng)增殖的CAR-T，在NSCLC中的研究表明，效應(yīng)子與靶標(biāo)的比率＞0.5:1時，MSLN-CAR-T細(xì)胞比T細(xì)胞具有更強(qiáng)的抗腫瘤能力。另外在體內(nèi)實(shí)驗中還觀察到，向尾靜脈注射MSLN-CAR-T細(xì)胞的小鼠的腫瘤生長明顯較慢。但是如果不連續(xù)給藥，兩組小鼠腫瘤生長情況逐漸趨同，這也顯示CAR-T細(xì)胞的持久性問題有待進(jìn)一步研究[16]。

3 增強(qiáng)CAR-T的功能及相關(guān)毒性的管理

3.1 增強(qiáng)CAR-T的功能

3.1.1 ICOS和4-1BB共刺激提高CAR-T細(xì)胞的持久性CAR-T細(xì)胞作用的持久性與腫瘤的療效成正相關(guān)。誘導(dǎo)型T細(xì)胞共刺激物（inducible co-stimulator, ICOS）與Th1、Th2和Th17免疫的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)相關(guān)[17]。4-1BB是在活化的T細(xì)胞和自然殺傷（natural killer cell, NK）細(xì)胞上表達(dá)的誘導(dǎo)型共刺激受體，4-1BB在T細(xì)胞活化，持久性和記憶力中發(fā)揮重要作用[18]。研究[19]發(fā)現(xiàn)，CD8+T細(xì)胞的持久性依賴于用于重定向CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域（intracellular domain, ICD）提供的輔助作用。與基于4-1BB的CAR相比，在實(shí)體瘤模型中第三代CAR-T cells中結(jié)合使用ICOS和4-1BB ICD表現(xiàn)出優(yōu)異的抗腫瘤作用并提高了體內(nèi)持久性。

3.1.2 細(xì)胞外模塊（鉸鏈結(jié)構(gòu)域）對CAR-T治療效果的影響 CAR的更新迭代，主要集中在細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)模塊上。無信號的細(xì)胞外模塊對CARs的擴(kuò)增和治療效果研究甚少。有研究通過生成兩個帶有或不帶有鉸鏈域的CAR載體（分別靶向CD19、間皮素、PSCA、MUC1和HER2），系統(tǒng)地比較了鉸鏈域在體外和體內(nèi)對CAR-T細(xì)胞生長動力學(xué)，細(xì)胞因子產(chǎn)生和細(xì)胞毒性的影響。體外遷移試驗表明，鉸鏈增強(qiáng)了CAR-T細(xì)胞的遷移能力，證明鉸鏈有助于CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增。有趣的是，抗CD19 CAR的T細(xì)胞在體內(nèi)具有抗腫瘤能力與是否含有鉸鏈無關(guān)，而表達(dá)包含鉸鏈域的抗間皮素CAR的T細(xì)胞顯示出增強(qiáng)的抗腫瘤活性，證明鉸鏈能夠提高某些特定CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤功效，需要更多的研究來進(jìn)一步探索[20]。

3.2 CAR-T細(xì)胞學(xué)治療毒性 CAR-T細(xì)胞療法使用的相關(guān)不良事件，主要是細(xì)胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome, CRS）和神經(jīng)系統(tǒng)毒性。其中CRS的表現(xiàn)包括血細(xì)胞減少、凝血病和吞噬性淋巴細(xì)胞組織細(xì)胞增生等。神經(jīng)系統(tǒng)毒性包括癲癇發(fā)作和腦水腫等多種臨床癥狀。CAR-T細(xì)胞劑量和CAR設(shè)計與其不良反應(yīng)相關(guān)。在研發(fā)改良的CAR設(shè)計和T細(xì)胞產(chǎn)生方法可以改善全身持久性和活性同時，也需要對CART細(xì)胞毒性進(jìn)行進(jìn)一步的臨床研究[21,22]，雖然大多數(shù)不良事件可分為輕度或中度，但也會發(fā)生需要入ICU治療的嚴(yán)重且危及生命的并發(fā)癥。在實(shí)施細(xì)胞療法抗腫瘤藥物治療后的重癥癌癥患者，應(yīng)在ICU工作人員、腫瘤學(xué)家和器官專家的團(tuán)隊配合下進(jìn)行管理。同時需要更多臨床和臨床前研究改進(jìn)相關(guān)不良事件的病理生理學(xué)認(rèn)識及其診斷和治療管理[23]。

4 總結(jié)

CD19CAR-T在血液系統(tǒng)惡性腫瘤取得非凡成就，與其B細(xì)胞譜系細(xì)胞上的CD19統(tǒng)一且特異性表達(dá)關(guān)系密切。迄今為止，NSCLC等實(shí)體瘤中的腫瘤相關(guān)抗原（tumor-associated antigen, TAA）靶標(biāo)在強(qiáng)度和分布方面表現(xiàn)出異質(zhì)性，缺乏真正的腫瘤特異性抗原，這極大的限制了CAR-T的臨床效果。研究新穎的CAR設(shè)計克服抗原異質(zhì)性勢在必行，例如靶向雙TAA的CAR、串聯(lián)CAR和可轉(zhuǎn)換CAR以及抑制性CAR[24]。CAR-T療法最佳臨床效果，包括CAR-T細(xì)胞的活化、持久性和較小的CAR-T細(xì)胞介導(dǎo)的毒性。有必要將多種修飾結(jié)合起來，不斷優(yōu)化CAR-T細(xì)胞的親和力和持久性[25]。值得關(guān)注的是，NSCLC作為實(shí)體瘤物理障礙也亟需解決，研究開發(fā)標(biāo)準(zhǔn)化的3D腫瘤模型，使藥物在臨床應(yīng)用前獲得其安全性和有效性的驗證[26]。應(yīng)進(jìn)一步透徹了解CAR不同結(jié)構(gòu)域的功能以及相互影響，不斷改善CAR-T細(xì)胞的設(shè)計，以取得更好的治療效果。根據(jù)不同的免疫治療策略，為NSCLC患者免疫治療提供更多的選擇和方案。