李聰聰，楊光參，王艷偉

(溫州大學(xué) 數(shù)理學(xué)院，浙江 溫州 325035)

DNA是一種攜帶大量負電荷的長鏈有機聚合物，在極性溶液中，DNA分子會水解，其堿基對帶負電，當溶液中有陽離子時，DNA周圍會匯聚很多帶正電的抗衡離子，即陽離子與DNA表面負電荷相結(jié)合，此時DNA表面的負電荷會被中和，當DNA表面電荷被中和達到89%時，DNA凝聚就會發(fā)生[1-2]。DNA的許多凝聚劑，如金屬陽離子[3-4]、堿性蛋白質(zhì)[5-6]、多胺類[7-8]以及一些中性聚合物[9-10]和金屬混合物[11]都能使DNA產(chǎn)生凝聚或者縮合。

目前關(guān)于陽離子導(dǎo)致DNA凝聚的研究非常多，為科研乃至基因治療領(lǐng)域提供了極佳的理論基礎(chǔ)。在細胞中，帶負電的DNA被限制在一個很小的空間中，這個空間包含的很多陽離子和陰離子維持了這個小系統(tǒng)的平衡。細胞中的三磷酸腺苷和二磷酸腺苷都為攜帶負電荷的陰離子，其對DNA的作用還未可知。在研究陽離子對DNA凝聚的過程中也會引入陰離子，因此陰離子對DNA的作用顯得不可忽略。Saito等[12]，Yoshikawa等[13-14]用熒光顯微鏡對DNA的單分子觀察發(fā)現(xiàn)，單個DNA鏈在凝聚中經(jīng)歷了一個大的離散型轉(zhuǎn)變，具有高價態(tài)的陰離子會使DNA變成線圈態(tài)而不是凝聚態(tài)。將這種轉(zhuǎn)變歸因于DNA表面離子對的形成，在多價態(tài)陰離子存在時，由于其大的帶電量，導(dǎo)致溶液中更多的陽離子與其形成離子對而不能結(jié)合在DNA表面繼而影響DNA凝聚過程。Duc等[15]用Monte Carlo模擬方法證明在有陰離子的情況下，DNA 凝聚層表面的負電荷濃度略高導(dǎo)致了DNA過度充電的顯著減少。龔紅玲[16]利用等溫滴定量熱法定量研究DNA凝聚過程中溫度效應(yīng)及離子濃度效應(yīng)，用NaCl，NaF，Na2SO4，Na3PO4作用于精胺導(dǎo)致的DNA凝聚，結(jié)果發(fā)現(xiàn)精胺與DNA的結(jié)合常數(shù)從左到右依次逐漸減小，這表明陰離子對陽離子介導(dǎo)DNA 凝聚有抑制作用，而且抑制凝聚能力由大到小依次為PO43-，SO42-，F(xiàn)-，Cl-。蔣楊偉[17]依托分子動力學(xué)方法研究了粗?；Ｐ拖码p鏈DNA與帶正電樹枝狀分子復(fù)合物的相變行為,證明高價態(tài)陰離子的加入改變了DNA樹枝狀分子周圍的電荷空間分布，削弱了雙鏈DNA與樹枝狀分子的靜電相互作用，樹枝狀分子表層的電荷反轉(zhuǎn)引發(fā)了DNA與樹枝狀分子的吸附/解吸轉(zhuǎn)變。

雖然前人已經(jīng)做了大量關(guān)于陰離子對DNA凝聚影響的研究，但大都依賴于計算機模擬，并沒有通過實驗直觀地反映出陰離子作用的DNA的形貌的變化以及DNA表面電荷的中和情況。本文通過動態(tài)光散射(dynamic light scattering，DLS)和原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)技術(shù)，定量地研究了不同價態(tài)陰離子對陽離子中和DNA表面電荷的影響和對陽離子介導(dǎo)的DNA凝聚形貌的影響。結(jié)果表明，陰離子可以抑制DNA的凝聚，而且價態(tài)越高，抑制作用越強。

1 實驗儀器與材料

1.1 實驗儀器

Zetasizer nano ZS90 動態(tài)光散射裝置(英國Malvern Instrument Ltd)；Malvern DTS1070樣品池(英國Malvern Instrument Ltd.)；NanoWizard Ⅲ原子力顯微鏡(德國 JPK instrument AG公司)；NCHR-50原子力探針(瑞士Nano World公司)。實驗清洗儀器和配置藥品的超純水從Milli-Q純水機(Millipore，Billerica，MA，USA)獲得。

1.2 實驗材料

雙鏈λ-DNA(英國New England Biolabs)；TRIS (hydhoxymethy) aminomethane，氯化精胺(C10H24N4Cl4)，氯化鈉(NaCl)，六水合氯化鎂(MgCl2·6H2O)購自美國Sigma-aldrich公司，純度>99%，無需進一步純化即可使用。無水硫酸鈉(Na2SO4)、檸檬酸鈉(Na3C6H5O7·2H2O)、無水硫酸鎂(MgSO4)、檸檬酸鎂(C12H10Mg3O14)購自上海麥克林生化有限公司，純度> 99%。濃度為10 mmol/L的TRIS緩沖液用作配置藥品的原液和DNA的緩沖液。所有測量至少重復(fù)兩次以獲得一致的結(jié)果。在實驗中所用到的材料還有載玻片、離心管、注射器、槍頭、云母、培養(yǎng)皿等。

2 實驗原理與方法

2.1 動態(tài)光散射裝置

DLS通過樣品池可測量樣品的電泳遷移率，所謂的電泳意味著聚電解質(zhì)在施加電場的情況下沿著與正電荷相反的方向轉(zhuǎn)移，同介質(zhì)中的平衡離子作相對運動的現(xiàn)象。動態(tài)光散射是通過測量物質(zhì)被光照后出現(xiàn)的散射光的各項參數(shù)變化來研究粒子的大小和帶電情況的[18]，具有測量有效率高、可重復(fù)性好、準確度高等優(yōu)點。動態(tài)光散射測量裝置如圖1所示。

圖1 動態(tài)光散射裝置結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Diagram of dynamic light scattering

其相關(guān)測量原理如下：

(1)

其中f(κr)是κr的函數(shù)， 稱為Henry函數(shù)，r是粒子半徑，1/κ是德拜長度；η為介質(zhì)的黏度系數(shù)；ζ是Zeta電勢，ε是介質(zhì)的介電常數(shù)。利用DLS技術(shù)，被測粒子的Zeta電位將直接被測得，通過式(1)就能算得被測粒子的電泳遷移率。DLS技術(shù)廣泛地應(yīng)用于研究DNA與平衡離子之間的相互作用。

2.2 原子力顯微鏡

本實驗使用的AFM其內(nèi)部設(shè)有自動機器人和一架控制裝置，還有一個BioScience溫控系統(tǒng)和NanoScience系統(tǒng)(圖2)。AFM的組成部分有檢測系統(tǒng)、光電檢測器、掃描系統(tǒng)、探針、反饋控制系統(tǒng)?；境上衲Ｊ接薪佑|成像模式、非接觸成像模式、輕敲模式。原子力顯微鏡成像是通過一個非常尖銳的尖端掃描樣品表面，而尖端和樣品之間相互作用的力則是通過皮牛級力的靈敏度來監(jiān)測的。樣品被安裝在壓電掃描器上，該掃描器可確保高分辨率的三維定位，并且通過使用光學(xué)方法(激光、光電二極管)測量懸臂梁撓度來監(jiān)測尖端和表面之間的力[19]。

圖2 激光檢測原子力顯微鏡探針工作示意圖Fig.2 Laser detection of the AFM probe

2.3 樣品制備

2.3.1 動態(tài)光散射實驗樣品制備

用TRIS緩沖液將待測藥品分別稀釋為不同濃度比例，然后各取1000 μL到不同的離心管中，再依次向溶液中加2 μL-DNA，放在微型旋轉(zhuǎn)儀上等待20～30 min后，將其注入Zeta樣品池中，放入DLS中進行實驗。每次測試完后，將樣品池中溶液倒掉，更換不同濃度的溶液前，用注射器抽取去離子水沖洗至少3次，以免影響實驗結(jié)果精度。

2.3.2 原子力顯微鏡實驗樣品制作

用雙面膠將邊長約1 cm的小正方形云母片貼在載玻片的中心，之后使用磨砂膠帶貼在云母片上逐層撕去直到得到表面平整的樣品。取20 μL待測混合溶液滴在云母片上，靜置3～5 min后用移液器緩緩從一角吸走余液，然后取30 μL去離子水清洗殘留藥品，如此清洗10～12次，最后用氮氣吹干并將樣品放入干凈的培養(yǎng)皿中。實驗樣品詳細制備步驟如圖3所示。

圖3 原子力顯微鏡樣品制備步驟示意圖Fig.3 Procedure of sample preparation for AFM

3 實驗結(jié)果

3.1 不同價態(tài)陰離子對DNA表面電荷中和的影響

為了研究不同價態(tài)陰離子對陽離子中和DNA表面電荷過程的影響，在DLS實驗中用Cl-，SO42-，C6H5O73-作為陰離子，同時也有Na+或Mg2+存在溶液中，由于一價陽離子和二價陽離子都不能使DNA電荷逆轉(zhuǎn)，所以我們給每組溶液中加入了0.05 mmol/L含四價陽離子的氯化精胺(C10H24N4Cl4)作為DNA凝聚劑，查看DNA在不同價態(tài)陰離子下的電泳遷移率(圖4)。圖4中NaCl濃度從左至右依次為3，6，9，12，15，18 mmol/L,Na2SO4濃度從左至右依次為1.5，3，4.5，6，7.5，9 mmol/L,Na3C6H5O7濃度從左至右依次為1，2，3，4，5，6 mmol/L。由圖4可以看出，NaCl的電泳遷移率總是大于Na2SO4，而Na3C6H5O7在各點都是處于最小值。圖5是將溶液中的單價鈉鹽改為二價鎂鹽所得的各種混合溶液的DNA電泳遷移率。其中每組溶液仍加入0.05 mmol/L C10H24N4Cl4作為DNA凝聚劑，圖5中MgCl2濃度從左至右依次為1.5，3，4.5，6，7.5，9 mmol/L，MgSO4濃度從左至右依次為1.5，3，4.5，6，7.5，9 mmol/L，Mg3(C6H5O7)2濃度從左至右依次為0.5，1，1.5，2，2.5，3 mmol/L。在圖中看到相同陽離子濃度下，MgCl2的電泳遷移率總是大于MgSO4，而Mg3(C6H5O7)2在各點都是處于最小值。圖4、圖5均表明價態(tài)越高的陰離子對DNA表面電荷的中和作用抑制越強，可以看出隨著單價鹽和二價鹽濃度的增加，混合物溶液的電泳遷移率都在緩慢升高，但是始終沒有使DNA電荷逆轉(zhuǎn)。

圖4 0.05 mmol/L C10H24N4Cl4與含有不同價態(tài)陰離子的單價鹽溶液對DNA電泳遷移率的影響Fig.4 Effects of 0.05 mmol/L C10H24N4Cl4 and monovalent salt solution containing anions of different valencies on DNA electrophoretic mobility

圖5 0.05 mmol/L C10H24N4Cl4與含有不同價態(tài)陰離子的二價鹽溶液對DNA電泳遷移率的影響Fig.5 Effects of 0.05 mmol/L C10H24N4Cl4 and divalent salt solution containing anions of different valencies on DNA electrophoretic mobility

3.2 在不同價態(tài)陰離子存在下，陽離子與DNA復(fù)合物形態(tài)的AFM成像

由3.1節(jié)可見，陰離子可以使氯化精胺導(dǎo)致的DNA的電泳遷移率變小，對DNA的電荷中和有抑制作用，而且陰離子價態(tài)越高，對電泳遷移率的抑制作用越強。實驗中改變陽離子種類但控制相同的陽離子濃度，發(fā)現(xiàn)陰離子對DNA的電荷中和有同樣的抑制作用，而且也是有相同的趨勢。為了進一步分析陰離子對DNA凝聚作用的影響，通過AFM觀察了在不同價態(tài)陰離子下DNA凝聚體的形貌圖。同樣地，用氯化精胺作為DNA凝聚劑，引入Cl-，SO42-，C6H5O73-作不同價態(tài)的陰離子，同時引入了Na+或者Mg2+。不同價態(tài)陰離子在單價鹽溶液中對DNA- C10H24N4Cl4作用后的形態(tài)如圖6(b)～6(d)所示，圖6(a)作為對照只加入了0.01 mmol/L C10H24N4Cl4。圖6(b)～6(d)中對應(yīng)的溶液分別為60 mmol/L NaCl，30 mmol/L Na2SO4，20 mmol/L Na3C6H5O，都加入0.01 mmol/L C10H24N4Cl4。從圖6(a)可以看出，當只加入0.01 mmol/L C10H24N4Cl4時，DNA開始縮合呈現(xiàn)為即將凝聚的狀態(tài)。而在圖6(b)中DNA的凝聚形態(tài)變化也不是很大，可見60 mmol/L NaCl對DNA的凝聚形態(tài)影響很??；當在圖6(a)的基礎(chǔ)上加入30 mmol/L Na2SO4時，AFM形態(tài)如圖6(c)所示，盡管DNA已經(jīng)凝聚，但凝聚程度沒有圖6(a)強;圖6(d)顯示結(jié)果為DNA凝聚現(xiàn)象更弱?？梢娫谙嗤琋a+濃度下，高價陰離子相對低價陰離子，對DNA凝聚的抑制作用更強，使DNA的凝聚形態(tài)變得更加松散，進一步證實了有陰離子存在下，陽離子導(dǎo)致的DNA凝聚效果會減弱。

圖6 不同陰離子存在下C10H24N4Cl4和 Na+ 導(dǎo)致的DNA凝聚AFM圖像Fig.6 AFM images of DNA condensation induced by C10H24N4 Cl4 and Mg2+ in the present of different co-ions

同樣，將帶有不同價態(tài)陰離子的二價鹽加入0.01 mmol/L C10H24N4Cl4-DNA中，AFM測得的DNA形態(tài)如圖7所示，圖7(a)～7(c)中對應(yīng)的化合物濃度分別為27 mmol/L MgCl2，27 mmol/L MgSO4，9 mmol/L C12H10Mg3O14，然后在每種溶液中都加入0.01 mmol/L C10H24N4Cl4。圖7(a)與圖6(a)相比，DNA從花狀結(jié)構(gòu)變成了網(wǎng)狀形態(tài)，說明DNA- C10H24N4CL4復(fù)合物在加入Mg2+后會促進凝聚，凝聚效果更明顯，主要原因是二價陽離子存在后，可作為云母連接DNA的橋梁，從而使多價陽離子更好地起到凝聚的效果；相對于圖7(a)，圖7(b)DNA凝聚作用有稍微減弱；圖7(c)相對于圖7(b)的DNA凝聚作用變得更弱，說明在陰離子存在下，濃度相同的二價陽離子與精氨離子共同作用的DNA凝聚程度會降低，并且陰離子價態(tài)越高，對DNA凝聚程度的抑制作用越大。

圖7 不同陰離子存在下C10H24N4Cl4和Mg2+ 導(dǎo)致的DNA凝聚AFM圖像Fig.7 AFM images of DNA condensation induced by C10H24N4 Cl4 and Mg2+ in the present of different co-ions

4 結(jié)論

本文通過動態(tài)光散射和原子力顯微鏡實驗研究了DNA的電泳遷移率變化和DNA形貌的變化，較為系統(tǒng)地證明了在單價或者二價陽離子與C10H24N4Cl4存在下陰離子對DNA凝聚作用的影響。結(jié)果表明，陰離子阻礙了陽離子中和DNA表面電荷的過程，并且抑制了DNA的凝聚。原因是溶液中的陰離子會結(jié)合陽離子形成離子對，與低價的陰離子相比，高價的陰離子在DNA表面結(jié)合更多的陽離子形成了離子對，阻止了溶液中的陽離子結(jié)合DNA表面的負電荷，繼而抑制了DNA的電荷中和與凝聚過程。通過陰離子作用的DNA表面電荷的變化和DNA形貌圖的觀察，本研究可以為進一步研究陰離子對DNA凝聚過程的影響提供一些理論指導(dǎo)，同時，陰離子對DNA的抑制凝聚作用在基因治療領(lǐng)域也成為了一個不可忽略的因素。