汪宗清，聶紅科，李青璇，王興強，湯小虎,*

(1.云南中醫(yī)藥大學，云南 昆明 650500;2.云南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院， 云南 昆明 650032)

新冠肺炎(COVID-19)是由新型冠狀病毒(2019-nCoV)感染引起的傳染性疾病，2019年12月在中國武漢爆發(fā)，隨后疫情迅速蔓延至全國，在其他國家和地區(qū)也大量出現(xiàn)。截至2020年3月30日，全球累計確診70余萬例，我國累計確診82 505例，治愈出院75 949例，現(xiàn)有確診3243例。目前疫情在我國的蔓延勢頭已逐漸放緩，但國外疫情仍十分嚴峻，全球疫情防控形式不容樂觀。隨著符合出院標準的新冠肺炎患者逐日增多，恢復期的中醫(yī)治療應受到關注。為避免恢復期患者癥狀加重或再度出現(xiàn)核酸檢測轉陽性，全國各省市相繼推出了新冠肺炎恢復期中醫(yī)康復指南，北京中醫(yī)藥學會肺系病專業(yè)委員會在廣泛聽取院士、國醫(yī)大師、名老中醫(yī)、溫熱病大家、肺病專家等臨床專家尤其是一線醫(yī)生等方面意見的基礎上，制定發(fā)表了《新型冠狀病毒肺炎恢復期中醫(yī)藥綜合干預方案專家指導意見(草案)》[1]，提出正虛邪戀是新冠肺炎恢復期之病機根本，因此中醫(yī)藥綜合干預除了清除殘留之病邪外，還應當顧護機體正氣，針對恢復期患者肺脾氣虛之證，推薦黃芪六君子湯作為基礎方，這與國家衛(wèi)生健康委員會和國家中醫(yī)藥管理局聯(lián)合發(fā)布的《新冠肺炎診療方案(試行第七版)》[2]推薦處方基本相同。

國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第三版)》首次明確了新冠肺炎屬于中醫(yī)“疫”病范疇[3]，致病因素為濕毒，核心病機為濕毒壅肺、阻遏氣機，病程中濕毒之邪蘊于臟腑、困阻氣機，且患者久臥病榻，肢體欠伸展，過分憂思病情而氣機閉郁，肺脾兩傷?？傊?，新冠肺炎恢復期病機以正虛為本，邪氣留擾為標，《醫(yī)學集成》[4]言“病后，調(diào)脾進食”。黃芪六君子湯以六君子湯為底，六君子湯原多用于脾胃病的治療，亦為培土生金法代表方, 可用于脾虛水液運化失常, 聚水液而成痰濕, 癥見咳嗽、咳痰,并夾雜脾虛證候的肺系疾病。塔娜等[5]運用加味六君子湯治療患兒過敏性咳嗽穩(wěn)定期(中醫(yī)辨證屬肺脾氣虛)，發(fā)現(xiàn)其明顯有效。楊靖罡等[6]運用六君子湯加減治療老年患者的慢性肺部感染(脾肺氣虛證),發(fā)現(xiàn)可改善患者各方面癥狀以及提高患者生活質(zhì)量。林水玉[7]通過臨床實驗研究發(fā)現(xiàn)，六君子湯可明顯改善慢性阻塞性肺疾病肺脾氣虛型患者的臨床癥狀及肺功能,能減低IL8，TNFα等細胞因子的水平。黃芪六君子湯由六君子湯加黃芪、紫蘇、桔梗組成，具有健脾益肺、燥濕化痰的功效，針對新冠肺炎恢復期患者正虛為本，邪留為標，可達到標本同治，肺脾雙補的功效。本研究基于網(wǎng)絡藥理學，整理分析黃芪六君子湯與新冠肺炎在有效成分、作用靶點及通路等方面的聯(lián)系，探討其潛在的作用機制，以期為治療新冠肺炎恢復期肺脾氣虛證患者提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件

數(shù)據(jù)庫和軟件主要包括:TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、Uniport數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)、STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)、GO數(shù)據(jù)庫(http://geneontology.org/)、KEGG數(shù)據(jù)庫(https://www.kegg.jp/)、Cytoscape3.7.2軟件(https://cytoscape.org/)、R3.6.2軟件(https://mirrors.#edu.cn/CRAN/)。

1.2 黃芪六君子湯的化學成分

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索黃芪六君子湯9味中藥化學成分，其中黃芪、人參、茯苓、白術、陳皮、半夏、紫蘇、桔梗篩選條件為口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18的化學成分，甘草符合OB≥50%且DL≥0.18的化學成分作為活性成分，并下載相關化合物的靶點信息。TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢活性成分相關的靶點，如該數(shù)據(jù)庫中無對應靶點，則進一步通過Pubchem數(shù)據(jù)庫檢索活性成分，并查詢其所對應的2D結構，保存為SDF文件，上傳至Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫，基于反向分子對接原理進行靶點預測，得到相關的預測靶點。整合以上靶點并去重，最后將篩選得到的所有靶點均經(jīng)Uniport數(shù)據(jù)庫轉化成蛋白質(zhì)ID格式，以便于后續(xù)處理分析。

1.3 新冠肺炎相關靶點的獲取及與黃芪六君子湯靶點的映射

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取疾病相關靶點，以“novel coronavirus pneumonia”作為檢索詞，將篩選得到的疾病靶點與藥物靶點進行映射，獲得黃芪六君子湯治療新冠肺炎的潛在作用靶點。

1.4 活性成分-靶點網(wǎng)絡構建

利用Cytoscape軟件，將上述得到的活性成分、共同靶基因數(shù)據(jù)導入軟件中，制作活性成分-靶點網(wǎng)絡圖，并計算其度值(degree)，篩選出核心成分。

1.5 蛋白互相作用網(wǎng)絡的構建與核心靶點的分析

將共同靶基因數(shù)據(jù)導入STRING數(shù)據(jù)庫，限定研究物種為“Homo sapiens”，設置連接評分最小值為0.700，獲得蛋白互作關系，導出TSV文件。將文件導入Cytoscape軟件進行可視化分析, 并利用cytoHubba插件找到黃芪六君子湯治療新冠肺炎的關鍵靶點。

1.6 基因本體 (GO) 功能富集和京都基因與基因組百科全書 (KEGG) 通路富集分析

利用R軟件中Bioconductor生物信息軟件包，將共同靶基因轉換成基因ID，以P<0.05進行關鍵靶基因的GO和KEGG功能富集分析，GO富集分析又包括生物過程(biological process, BP)、分子功能(molucular function, MF)和細胞組分(cellular component, CC)3個分支。結果以條形圖或氣泡圖形式輸出。

1.7 靶點-作用通路網(wǎng)絡的構建

將生成的靶點-通路關系文件導入Cytoscape軟件，構建靶點-作用通路網(wǎng)絡。

2 結果

2.1 黃芪六君子湯活性成分和潛在靶點

通過篩選條件，從TCMSP數(shù)據(jù)庫中共獲得黃芪六君子湯145個活性成分。其中白術7個、半夏13個、陳皮5個、茯苓15個、甘草42個、黃芪20個、桔梗7個、人參22個、紫蘇14個。整合TCMSP和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫預測，以及通過Uniprot數(shù)據(jù)庫校正去重，共獲得1618個化合物相關潛在靶點。

2.2 新冠肺炎相關基因

在GeneCards數(shù)據(jù)庫中共找到259個新冠肺炎相關基因，評分排名前5的靶點分別是甘露糖結合凝集素2(MBL2)、人類白細胞抗原組織相容復合物B(HLA-B) 、腫瘤壞死因子(TNF)、甘露聚糖結合凝集素絲氨酸肽酶2(MASP2)、白細胞介素6(IL6)，與黃芪六君子湯活性成分潛在靶點對比，共有37個共同基因。

2.3 活性成分-靶點網(wǎng)絡的構建

將黃芪六君子湯治療新冠肺炎的37個靶基因與篩選出來的活性成分映射，建立活性成分與靶基因對應關系，導入Cytoscape 軟件，繪制網(wǎng)絡圖，特定顏色代表化合物來自不同中藥，見圖1。并對該網(wǎng)絡圖中的活性成分的度值進行分析?；钚猿煞值亩戎当硎酒渌鶎陌悬c個數(shù)，這意味著度值越大，在治療新冠肺炎的過程中所發(fā)揮的作用也越大。其中對應靶點數(shù)大于10的活性成分有木犀草素(luteolin)、山柰酚(kaempferol)、川皮苷(nobiletin) 、柚皮素(naringenin)、黃芩素(baicalein)、金合歡素(acacetin)共6個，分別能與18，14，11，11，10，10個靶點連接，對治療新冠肺炎具有重要的意義，詳見表1。表1中選取度值大于等于5的活性成分進行展示。

圖1 活性成分-作用靶點網(wǎng)絡Fig.1 Components-key targets network

表1 關鍵化合物的基本信息(度值大于等于5)Table 1 Basic information on the key compounds(The degree value is greater than or equal to 5)

續(xù)表1

2.4 核心靶點互作圖

將37個共同靶基因導入String數(shù)據(jù)庫中，刪除游離蛋白1個，剩余36個蛋白，獲得蛋白互作關系。然后導出TSV文件，將蛋白互作關系網(wǎng)絡導入Cytoscape軟件，運用CytoHubba插件根據(jù)節(jié)點度值大小進行排列，顏色由深黃變?yōu)闇\黃，節(jié)點由大變小，顏色越深，節(jié)點越大，則度值越大，見圖2。具體度值見表2，表中平均節(jié)點數(shù)為21個，有24個蛋白節(jié)點數(shù)高于均值，絲裂原活化蛋白激酶1/3/8/14(MAPK1/3/8/14)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3/8(CASP3/8)、白介素6/1β(IL6/1β)、白蛋白(ALB)，細胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白(BCL2L1)、人前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)、原癌基因c-fos(FOS)、RELA原癌基因(RELA)等基因的度值高于25，說明這些節(jié)點在整個網(wǎng)絡中起著關鍵的作用，可能是黃芪六君子湯治療新冠肺炎的關鍵靶點。

圖2 Cytoscape蛋白互作網(wǎng)絡 Fig.2 PPI network of cytoscape

表2 PPI中的核心基因Table 2 Core genes in PPI

2.5 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析

使用R軟件37個共同靶點進行GO功能富集分析，其中生物學過程1421條，分子功能63條，細胞組成36條，篩選出排名前20的分子功能，其中預測靶點在生物過程中抗氧化反應(response to oxidative stress)、對金屬離子的反應(response to metal ion)、對活性氧的反應(response to reactive oxygen species)列前三位；在細胞組分中細胞膜膜筏(membrane raft)、膜微區(qū)(membrane microdomain)、膜區(qū)(membrane region)比例最大；而在分子功能中磷酸酶結合(phosphatase binding)和BH域連接(BH domain binding)關系最密切,具體結果見圖3～5。圖中左側縱坐標為GO名稱，橫坐標為富集基因數(shù)，顏色代表P值，顏色越紅，富集的程度越高，相應的P值越小。

圖3 GO通路富集分析的BP分析氣泡圖(前20)Fig.3 BP analysis of GO pathway enrichment analysis by bubble diagram (top 20)

圖4 GO通路富集分析的CC分析氣泡圖(前20)Fig.4 CC analysis of GO pathway enrichment analysis by bubble diagram (top 20)

圖5 GO通路富集分析的MF分析氣泡圖(前20)Fig.5 MF analysis of GO pathway enrichment analysis by bubble diagram(top 20)

通過KEGG分析結果顯示共有41條KEGG代謝通路參與其中,篩選出排名前20條通路,見圖6。圖中左側縱坐標為pathway名稱，橫坐標為富集基因比例，圓圈越大，所富集基因比例越大，P值代表富集的顯著性，顏色越紅，富集的程度越高。主要涉及PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、細胞凋亡(apoptosis)、內(nèi)分泌阻力(endocrine resistance)、MAPK 信號通路(MAPK signaling pathway)、Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)、破骨細胞分化(osteoclast differentiation)、NOD樣受體信號通路(NOD-like receptor signaling pathway)、RAS信號通路(Ras signaling pathway)等。提示黃芪六君子湯通過調(diào)節(jié)多種代謝通路共同發(fā)揮治療新冠肺炎的作用。

圖6 KEGG通路富集分析氣泡圖(前20) Fig.6 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis(top 20)

2.6 靶點-作用通路網(wǎng)絡構建

將靶點-通路關系文件導入Cytoscape 3.7.2軟件, 37個靶點可富集到41條信號通路中,選取排名前20的KEGG代謝通路，構建黃芪六君子湯治療新冠肺炎靶點-作用通路網(wǎng)絡,見圖7，圖中黃色代表基因，紅色代表通路，圖形越大，說明該節(jié)點度值越大。其中MAPK1/8/3/14，IL6/1β，BCL2/L1，RELA，F(xiàn)OS，EGFR等在各通路中富集次數(shù)比較多，見表3。

圖7 靶點-信號通路網(wǎng)絡Fig.7 Target-pathway network

表3 KEGG通路分析結果(前20)Table 3 KEGG pathway analysis results (top 20)

3 討論

黃芪六君子湯具有健脾益肺，燥濕化痰之功，主治新型冠狀病毒恢復期肺脾氣虛證，旨在避免患者瘥后復發(fā)。正如葉天士所言“恐爐煙雖熄，灰中有火也”，在新冠肺炎恢復期多以肺脾氣虛為主，正虛邪戀。《內(nèi)外傷辨惑論·飲食勞倦論》有言“脾胃一虛，肺氣先絕”，脾胃為后天之本，脾為肺之母臟，脾氣健旺則氣血生化有源，腠理致密，肺不得侵。黃芪六君子湯中以人參大補元氣，復脈生津，黃芪補肺固表，兩藥合用為君而大補肺脾之氣，使正氣得復；法半夏、陳皮燥濕化痰，炒白術、茯苓健脾除濕，四藥為臣使邪有出路；紫蘇梗、桔梗合為佐藥以開宣肺氣，引藥力上達肺絡；甘草調(diào)和諸藥，亦可健脾祛痰。全方補而不滯，共奏肺脾同治，補土生金，祛邪扶正之功。

通過網(wǎng)絡藥理學研究發(fā)現(xiàn)，黃芪六君子湯的活性成分145個化合物，可在體內(nèi)作用于1618個靶點，根據(jù)相互作用靶點數(shù)，排名前6的依次是木犀草素、山柰酚、川皮苷、柚皮素、黃芩素、金合歡素，6個化合物均屬于黃酮類化合物，黃酮類化合物具有廣泛的生物學作用，在抗黃嘌呤氧化酶活性、免疫調(diào)節(jié)[8]等方面均具有顯著效果。研究表明，黃酮類化合物能夠通過抑制NOX4/NFkB/MLCK途徑減輕甲型流感病毒誘導的屏障功能障礙，可能是防治肺內(nèi)皮屏障功能障礙和甲型流感病毒的潛在藥物[9]。木犀草素常用于消炎止咳、祛痰平喘等，能顯著抑制流感病毒的增殖和炎性細胞因子表達，影響凋亡相關因子和通路的表達[10]，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗肝纖維化等作用[11]。山奈酚具有抗炎、抗氧化、抗病毒、增強機體免疫等多種藥理作用[12]。川皮苷、柚皮素具有抗氧化、抗凋亡、抗纖維化、抗炎、抗癌、抗病毒等作用[13-14]。金合歡素具有抗氧化、抗炎抑菌、免疫調(diào)節(jié)等作用[15]。黃芩素具有抗氧化、抗病毒等多種藥理活性，還可抑制病毒細胞的增殖，阻止艾滋病病毒復制、改善甲型流感病毒誘導的急性肺損傷[16]。以上核心成分協(xié)同參與免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗炎、改善肺損傷及抗纖維化等功能，可能作為黃芪六君子湯治療新冠肺炎的主要藥效群。血管緊張素轉化酶Ⅱ(ACE2)是SARS-CoV細胞侵入人體并進行病毒復制所必須的關鍵環(huán)節(jié)[17]，當前已有學者將木犀草素、山柰酚、黃芩素與ACE2和新型冠狀病毒進行分子對接，以及將川皮苷、柚皮素、金合歡素與新型冠狀病毒進行對接后發(fā)現(xiàn)[18-22]，這些化合物分子具有同治療新型冠狀病毒肺炎常用藥物如瑞德西韋、利巴韋林、利托那韋相近甚至更強的結合力。可見，運用網(wǎng)絡藥理學預測黃芪六君子湯治療新冠肺炎的潛在物質(zhì)基礎具有一定的可靠性。

通過PPI網(wǎng)絡結果分析，MAPK1/3/8/14，CASP3/8，IL6/1β，ALB，BCL2L1，PTGS2，F(xiàn)OS，RELA是黃芪六君子湯治療新冠肺炎的主要蛋白，而MAPK1，MAPK3，MAPK8和MAPK14都屬于絲裂原活化蛋白激酶家族，在滲透壓改變、氧化應激、炎性因子和病毒感染等內(nèi)環(huán)境改變時可被刺激磷酸化而激活[23]，故在PPI網(wǎng)絡中與其他基因關系較為密切。CASP3和CASP8是半胱氨酸蛋白酶家族成員，是凋亡機制的關鍵因子，啟動子CASP8可以作用于CASP3的天冬氨酶，使得CASP3作用于特定細胞底物的關鍵裂解，最終導致細胞凋亡[24]。IL6，IL1β同屬白介素家族，是重要的炎癥因子，共同作用參與炎癥的病理過程。BCL2L1是Bcl-2蛋白家族的一員，在細胞凋亡中起關鍵作用，許多抗癌藥物通過靶向Bcl-2家族蛋白誘導細胞凋亡[25]。FOS是原癌基因，可參與各效應酶信號傳遞系統(tǒng)的轉錄過程,調(diào)控其他多種基因的靶蛋白合成,從而影響細胞的增殖和分化[26]。RELA是NFκB家族成員之一，參與調(diào)控抗中性粒細胞凋亡，通過調(diào)控KLF-2抑制促炎因子的表達、內(nèi)皮細胞的活化以及炎癥細胞、黏附等抗炎作用對肺組織炎癥產(chǎn)生影響[27]。結合GO功能結果分析可知，黃芪六君子湯治療新冠肺炎的靶點主要通過炎癥反應、細胞凋亡、氧化還原、免疫應答等過程對疾病產(chǎn)生治療作用。

在KEGG通路富集結果中顯示，黃芪六君子湯治療新冠肺炎的核心靶點主要涉及PI3K-Akt信號通路、細胞凋亡、內(nèi)分泌阻力、MAPK 信號通路、Toll樣受體信號通路、破骨細胞分化、NOD樣受體信號通路、RAS信號通路等，富集在炎癥相關通路所占比例較多，提示黃芪六君子湯可能作用于多種細胞因子而抑制細胞因子風暴。有研究證明，PI3K-Akt信號通路在SARS-CoV和MERS-CoV的感染過程中起到重要作用，并可能作為抵御冠狀病毒的藥物靶標[28]。MAPK，RAS等信號通路與肺癌、肺纖維化以及氣道炎癥等肺部疾病密切相關[29-31]，Toll樣受體被認為是抵御入侵微生物的第一道防線，可誘發(fā)NFκB信號通路活動，進一步誘發(fā)IL1β等相關基因表達，同時可調(diào)節(jié)免疫反應中涉及的多種基因的表達[32]，Totura等[33]研究表明，Toll樣受體缺失的小鼠比野生型小鼠更易感染SARS-CoV，NOD樣受體作為先天性免疫應答的一部分，參與抗細菌、病毒免疫應答[34]。

綜上所述，基于網(wǎng)絡藥理學的研究方法，可得出黃芪六君子湯主要通過抗病毒、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用機制對新冠肺炎發(fā)揮治療作用。但由于網(wǎng)絡藥理學的局限性以及目前對新型冠狀病毒致病機制的認識不足，研究結果還存在一定的偏差，需在實驗及臨床中進一步驗證。