劉 輝 陳小東 黃浩南 邱群鳳

1 福建醫(yī)科大學(xué)附屬龍巖第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建省龍巖市 364000； 2 福建省龍巖市疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科

鮑曼不動(dòng)桿菌(AB)是一類機(jī)會(huì)性致病菌，廣泛存在于自然界和人體皮膚表面，通常引起醫(yī)院感染，主要包括呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎、導(dǎo)管相關(guān)性菌血癥、尿路感染、腦膜炎和軟組織感染等。它通常在危重癥病人中具有較高的發(fā)病率和死亡率[1-3]。目前，多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌正通過全球各地的醫(yī)院迅速感染和傳播，其最常在重癥監(jiān)護(hù)病房爆發(fā)流行[4-5]，因鮑曼不動(dòng)桿菌具備多種天然耐藥和強(qiáng)大的獲得耐藥及克隆傳播的能力，以及其可以生物膜的形式存活在外部環(huán)境，使其能有效抵抗消毒劑、紫外線和宿主免疫的殺傷，并在醫(yī)院環(huán)境下長期生存，對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌感染的預(yù)防及治療已是臨床上的棘手問題[6]。

由于良好的抗菌活性和安全性，氟喹諾酮類藥物廣泛應(yīng)用于各類革蘭桿菌感染的治療，并作為常見碳青霉烯耐藥革蘭陰性桿菌(Carbapenem-resistant Organism,CRO)首選推薦藥物之一[7]，但隨著氟喹諾酮類藥物使用的增加導(dǎo)致院內(nèi)臨床株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)這些抗生素的耐藥性快速上升。然而，對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥性通常是由靶酶的改變引起的(DNA回轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ)[8-9]，其次是外排泵的改變和質(zhì)粒介導(dǎo)Qnr蛋白的產(chǎn)生，有報(bào)道，Qnr蛋白可以保護(hù)喹諾酮類藥物不受抑制，但Qnr本身只產(chǎn)生低水平的耐藥性，同時(shí)Qnr蛋白的存在卻一定程度上促進(jìn)了高水平耐藥性突變的選擇。DNA gyrase的亞基分別是gyrA基因編碼的97-kDa蛋白gyrA和90-kDa蛋白gyrB。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的相應(yīng)亞基為parC(75kDa)，gyrA (Ser83Leu)和ParC(Ser80Leu)單氨基酸的替換鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)喹諾酮類藥物的高水平耐藥有關(guān)，耐藥性的程度因生物和地理區(qū)域而異[10]。為了解臨床株鮑曼不動(dòng)桿菌gyrA和parC基因的普遍突變與耐藥性的關(guān)系，及gyrA和parC突變的風(fēng)險(xiǎn)因素；本研究擬對(duì)臨床分離株鮑曼不動(dòng)桿菌gyrA和parC基因突變進(jìn)行檢測，詳細(xì)分析如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集2017年9月—2018年12月福建醫(yī)科大學(xué)附屬龍巖第一醫(yī)院發(fā)生下呼吸道AB感染的住院病人39例，非重復(fù)分離其痰液標(biāo)本AB菌，下呼吸道AB感染診斷標(biāo)準(zhǔn)同相關(guān)文獻(xiàn)[11-12]，采用美國BD公司Phoenix100全自動(dòng)微生物鑒定儀及配套試劑鑒定菌種。銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸埃希菌ATCC25922購自英國Oxoid公司。

1.2 主要試劑及儀器 LB培養(yǎng)液和PBS緩沖液(上海榕柏公司)；PCR試劑盒(大連寶生物公司)；DNA Ladder(北京天根公司)；Phoenix100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏系統(tǒng)(美國BD公司)；PCR擴(kuò)增儀(Bio-rad公司)；DYY-10C電泳儀、WD-9413B凝膠成像分析儀(北京六一儀器廠)；5424臺(tái)式高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；PCR引物由上海生工公司合成。

1.3 藥敏實(shí)驗(yàn) 采用Phoenix100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏系統(tǒng)及配套試劑測定菌株對(duì)藥物的最低抑菌濃度(MIC)，并根據(jù)美國CLSI 2018判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥物敏感性判斷。其中對(duì)頭孢菌素類、碳青霉烯類、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的復(fù)合制劑、氟喹諾酮類和氨基糖苷類5類抗生素中≥3類耐藥者判為多重耐藥；對(duì)除了多黏菌素外的所有藥物耐藥者判為泛耐藥。

1.4 基因檢測 采用煮沸法提取菌株DNA，挑取新鮮菌落至100μl 去離子H2O煮沸10min，3 000r/min，10min，吸取上清液置于-20℃?zhèn)溆谩CR法檢測gyrA和parC基因，靶基因引物序列見表1，基因擴(kuò)增體系為25μl：上、下游引物(10μmol/L)各1μl，PCR Taq酶(5U/μl)0.125μl，10×PCR Buffer 2.5μl，dNTP(2.5mmol/L)2μl，MgCl22μl，H2O 13.875μl，DNA模板2.5μl。gyrA及parC基因PCR循環(huán)參數(shù)為：94℃ 1min；98℃ 10s，60℃ 1min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。產(chǎn)物經(jīng)15g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察，分子量與產(chǎn)物預(yù)期分子量相當(dāng)?shù)呐袨殛栃浴U(kuò)增產(chǎn)物純化后送公司測序。

表1 靶基因PCR引物序列和產(chǎn)物長度

2 結(jié)果

2.1 39株臨床株AB菌中，gyrA和parC雙基因突變率為56.4%，gyrA單基因突變率為7.7%，parC單基因突變率為5.1%。見表2。

表2 鮑曼不動(dòng)桿菌中g(shù)yrA及parC基因的突變情況

2.2 gyrA和parC雙基因突變株左氧氟沙星MIC≥64，環(huán)丙沙星MIC≥16，gyrA或parC單基因突變左氧氟沙星MIC≥8，環(huán)丙沙星MIC≥2。見表3。具體基因測序圖詳見圖1～3。

2.3 攜帶gyrA和parC突變AB菌組病人較攜帶無突變組病人住院時(shí)間長(P<0.05)；且呼吸機(jī)、氣管插管、血液制品及抗生素的使用率更高(P<0.05)。見表4。

2.4 抗生素的使用是gyrA和parC突變獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表5。

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌作為我國醫(yī)療系統(tǒng)院內(nèi)感染的主要病原體之一，它對(duì)紫外線、濕熱和化學(xué)消毒劑有較強(qiáng)的抵抗力，在自然界、醫(yī)院環(huán)境、各類醫(yī)療器材上定植率都非常高。氟喹諾酮類藥物作為常見碳青霉烯耐藥革蘭陰性桿菌首選推薦藥物之一，對(duì)其耐藥是全球抗感染領(lǐng)域面臨的嚴(yán)重威脅[9]，主動(dòng)開展對(duì)氟喹諾酮類藥物及其他多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的感染及定植監(jiān)測，并進(jìn)行耐藥分析和流行株的突變分析，掌握本機(jī)構(gòu)內(nèi)耐藥菌株的流行動(dòng)態(tài)，可有效指導(dǎo)臨床抗感染治療和院感防控。

表3 鮑曼不動(dòng)桿菌中g(shù)yrA及parC基因的突變與左氧氟沙星及環(huán)丙沙星的MIC

A敏感株 B耐藥株

A敏感株 B耐藥株

研究表明，gyrA和parC的基因突變導(dǎo)致的氨基酸置換在革蘭氏陰性桿菌對(duì)奎諾酮的耐藥中起著重要作用[10]，但gyrA和parC氨基酸的替換在不同革蘭氏陰性桿菌發(fā)生的奎諾酮類耐藥作用不同，在銅綠假單胞菌中，對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥性主要是由于gyrA基因的突變[13]，gyrA和parC雙基因突變是鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)奎諾酮類藥物高水平耐藥的主要原因[14-15]，而gyrA和parC基因的三或四種基因位點(diǎn)的突變常導(dǎo)致鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)環(huán)丙沙星的高水平耐藥。筆者比較臨床株鮑曼不動(dòng)桿菌gyrA和parC基因的檢測情況后發(fā)現(xiàn)，本研究中尚無同時(shí)發(fā)生三種及以上基因位點(diǎn)突變的菌株，其中本機(jī)構(gòu)內(nèi)氟喹諾酮類藥物耐藥的主要流行株是gyrA和parC雙基因位點(diǎn)突變株，其分別是gyrA基因第83位堿基TCA-TTA的點(diǎn)突變和parC基因第80堿基TCG-TTG的點(diǎn)突變，而gyrA(Ser83Leu)和parC(Ser80Leu)的雙突變菌株環(huán)丙沙星MIC均≥16，左氧氟沙星MIC均≥64，這與其他研究報(bào)道耐藥機(jī)制相似。此外，筆者還發(fā)現(xiàn)少數(shù)parC基因第84堿基GAA-AAA的點(diǎn)突變即parC(Glu84Lys)突變，以及gyrA(Ser83Leu)和parC(Ser80Leu)的單一突變，單一突變環(huán)丙沙星MIC≥2，左氧氟沙星MIC≥8。其中，gyrA和parC雙突變的菌株環(huán)丙沙星及左氧氟沙星的MIC均高于單一突變菌株(P<0.05)。比較分別感染無gyrA和parC突變和gyrA和parC突變的AB菌病人的臨床資料后發(fā)現(xiàn)，感染gyrA和parC突變AB菌組病人住院時(shí)間、呼吸機(jī)使用率、氣管插管率、血液制品的輸注及抗生素的使用率均高于感染無gyrA和parC突變組病人(P<0.05)，其中，抗生素的使用率是AB菌gyrA和parC突變的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素(P<0.05)，但本文僅初步探討AB菌gyrA和parC突變可能存在的風(fēng)險(xiǎn)因素，研究樣本量較小，數(shù)據(jù)可能不能完全分析各類抗生素的使用等其他臨床因素對(duì)AB菌gyrA和parC突變的影響；此外，AB菌的耐藥與病人本身的免疫水平有很大關(guān)系，免疫壓力和藥物壓力可誘導(dǎo)AB菌發(fā)生耐藥，病情嚴(yán)重的患者往往合并有較多的基礎(chǔ)性疾病，也更有可能接受更多種抗生素的治療，本研究沒有對(duì)這些因素調(diào)整后進(jìn)行分析，因此，需大規(guī)模、前瞻性的研究來證實(shí)各臨床因素可能成為AB菌gyrA和parC突變的風(fēng)險(xiǎn)因素。

表4 患者基線資料

表5 gyrA及parC基因突變的風(fēng)險(xiǎn)因素分析

綜上所述，gyrA(Ser83Leu)和parC(Ser80Leu)的雙突變菌株是本機(jī)構(gòu)AB菌對(duì)環(huán)丙沙星和左氧氟沙星耐藥的主要流行菌株，也是其對(duì)環(huán)丙沙星和左氧氟沙星高濃度耐藥的主要原因，而抗生素的使用是AB菌gyrA和parC突變的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。但本研究菌株及病例數(shù)較少，尚需擴(kuò)大樣本量分析AB菌gyrA和parC突變可能存在的其他風(fēng)險(xiǎn)因素。