潘 倩

（四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，成都610041）

0 引 言

細(xì)胞培養(yǎng)是包括醫(yī)學(xué)在內(nèi)的生命科學(xué)領(lǐng)域最重要、最基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一，它在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用十分廣泛，是學(xué)生今后從事專業(yè)相關(guān)工作所必須掌握的一門實(shí)驗(yàn)技能［1］。在細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，如何吸引學(xué)生的興趣、激發(fā)學(xué)生求知的欲望，使其在短時(shí)間內(nèi)掌握相關(guān)操作等這些問題給實(shí)驗(yàn)教師提出了很大的挑戰(zhàn)［2］。為此，在探究式學(xué)習(xí)的理論基礎(chǔ)上，利用3T3-L1 和L929 兩種細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件下增殖水平的差異，設(shè)計(jì)了“猜猜它是誰？——3T3-L1 和L929 細(xì)胞的增殖測(cè)定”這一綜合性與研究性實(shí)驗(yàn)，以期激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)主動(dòng)性和積極性，鍛煉學(xué)生的科研思維［3］，使其牢固掌握相關(guān)實(shí)驗(yàn)技能，切實(shí)提高學(xué)習(xí)效果和實(shí)驗(yàn)教學(xué)水平［4］。

1 教學(xué)設(shè)計(jì)

1.1 情境設(shè)計(jì)

①創(chuàng)設(shè)情境。老師告知學(xué)生現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室有2 種連續(xù)細(xì)胞株，3T3-L1（小鼠脂肪前體細(xì)胞）和L929（小鼠結(jié)締組織成纖維細(xì)胞），但由于在細(xì)胞凍存時(shí)只對(duì)兩種細(xì)胞標(biāo)記了A、B，并未寫具體名稱，已不能確認(rèn)A和B具體是哪種細(xì)胞。②給出線索（見表1）。③啟發(fā)思考。老師提出問題，請(qǐng)大家根據(jù)已知線索，設(shè)計(jì)不同的培養(yǎng)條件，通過對(duì)A、B 兩種細(xì)胞的增殖測(cè)定，猜猜它是誰？

表1 3T3-L1 細(xì)胞和L929 細(xì)胞的說明

1.2 教學(xué)目的

通過此實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)，使學(xué)生①了解體外培養(yǎng)環(huán)境中成纖維樣細(xì)胞和上皮樣細(xì)胞的形態(tài)特征；②熟悉細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的操作方法；③掌握無菌技術(shù)；④掌握細(xì)胞傳代技術(shù)；⑤掌握倒置顯微鏡觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的使用方法；⑥了解細(xì)胞計(jì)數(shù)方法；⑦掌握臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞；⑧了解細(xì)胞增殖測(cè)定方法；⑨掌握MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖［5-6］。

1.3 教學(xué)重點(diǎn)與難點(diǎn)

該探究式實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目的教學(xué)重點(diǎn)是無菌技術(shù)、細(xì)胞傳代技術(shù)、倒置顯微鏡的使用、臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞、MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖。教學(xué)難點(diǎn)是學(xué)生要根據(jù)已知線索，自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，通過對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析得出結(jié)論，這增加了實(shí)驗(yàn)的趣味性和探索性。

1.4 教學(xué)安排

該探究式實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目的教學(xué)內(nèi)容與學(xué)時(shí)安排見表2［7］，共計(jì)15 學(xué)時(shí)，分3 次進(jìn)行，其中第1 次與第2次的時(shí)間間隔不低于24 h，“細(xì)胞增殖測(cè)定”實(shí)際操作只需2 學(xué)時(shí)，其余6 學(xué)時(shí)為細(xì)胞孵育和甲臜結(jié)晶溶解所需時(shí)間，不同高?？筛鶕?jù)各自的教學(xué)要求對(duì)學(xué)時(shí)做適當(dāng)調(diào)整?？筛鶕?jù)細(xì)胞培養(yǎng)室的實(shí)際使用面積將學(xué)生分組，建議2 或3 人為1 小組，小組內(nèi)成員協(xié)調(diào)分工與合作，共同完成實(shí)驗(yàn)任務(wù)［8］。

表2 教學(xué)內(nèi)容與學(xué)時(shí)安排

1.5 考核評(píng)價(jià)

充分貫徹全過程考核和非標(biāo)準(zhǔn)答案考試，成績構(gòu)成［9］見表3，其中實(shí)驗(yàn)操作和實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果的匯報(bào)作為平時(shí)成績占總成績的80%；實(shí)驗(yàn)報(bào)告是在所有實(shí)驗(yàn)完成后，將3 次實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容整合形成1 篇綜合性實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

2 教學(xué)內(nèi)容

2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器設(shè)備

所需實(shí)驗(yàn)材料有：3T3-L1 細(xì)胞和L929 細(xì)胞（中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫），Dhanks（無鈣鎂離子，Solarbio），胰蛋白酶溶液（0.25%，Hyclone），DMEM 培養(yǎng)液（高糖，Gibco），新生牛血清（new-born bovine serum，NBCS，Gibco），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，中喬新舟），臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞存活率檢測(cè)試劑盒（碧云天），MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（碧云天），96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，不同規(guī)格的槍頭、離心管等。所需儀器設(shè)備有：超凈工作臺(tái)，CO2培養(yǎng)箱，恒溫水浴鍋，移液器，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，離心機(jī)，倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀等。

2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

（1）細(xì)胞傳代。打開超凈工作臺(tái)紫外燈，滅菌30 min，然后關(guān)閉紫外燈，打開超凈工作臺(tái)鼓風(fēng)機(jī)；在恒溫水浴鍋中37 ℃預(yù)熱DHanks液、胰蛋白酶溶液、DMEM培養(yǎng)液。在無菌超凈工作臺(tái)中，嚴(yán)格無菌操作，首先配制完全培養(yǎng)液，如90% DMEM ＋10% NBCS、90%DMEM ＋10%FBS；然后分別將A、B 兩種細(xì)胞的培養(yǎng)液去除，加入適量DHanks 液，清洗2 次；接著將DHanks液棄去后，加入適量胰蛋白酶，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若大部分細(xì)胞變圓，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加適量完全培養(yǎng)液終止消化。吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)的液體沖洗貼壁細(xì)胞，得到細(xì)胞懸液，輕輕混勻后取適量進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。

（2）活細(xì)胞計(jì)數(shù)。吸取50 μL細(xì)胞懸液，加入50 μL臺(tái)盼藍(lán)染色液（2 ×），輕輕混勻，染色3 min（不宜超過10 min）。取細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在計(jì)數(shù)區(qū)蓋上一塊邊緣經(jīng)輕輕潤濕的蓋玻片，將經(jīng)染色的細(xì)胞混勻，吸取20 μL滴加在蓋玻片邊緣，使細(xì)胞懸液通過毛細(xì)管作用充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間，去除多余液體（不要吸走蓋玻片下方的液體），將計(jì)數(shù)板置于顯微鏡下，在10 ×物鏡下采用“計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右”的原則計(jì)數(shù)中央大方格內(nèi)未被染色的活細(xì)胞，計(jì)數(shù)重復(fù)2 次，然后計(jì)算活細(xì)胞密度：活細(xì)胞密度（個(gè)／mL）＝未被染色的平均細(xì)胞數(shù)×104［10］。

（3）不同條件下的細(xì)胞接種培養(yǎng)。按自行設(shè)計(jì)的細(xì)胞培養(yǎng)方案將計(jì)數(shù)后剩余的細(xì)胞懸液平分，離心（1 000 r／min，5 min），去除上清，分別加入適量不同的完全培養(yǎng)液，混勻后分別向96 孔培養(yǎng)板中每孔加入約5 000 個(gè)活細(xì)胞，隨后加入相應(yīng)的完全培養(yǎng)液至100 μL。每種培養(yǎng)條件設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，隨后放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

表3 考核評(píng)價(jià)表

（4）細(xì)胞觀察。打開電源，將燈光強(qiáng)度從最低開始調(diào)至合適強(qiáng)度，將培養(yǎng)板放置在倒置顯微鏡載物臺(tái)上，左右移動(dòng)載物臺(tái)使光源對(duì)準(zhǔn)待觀察細(xì)胞，選擇合適倍數(shù)物鏡（一般由低倍到高倍），雙眼從目鏡中觀察，轉(zhuǎn)動(dòng)調(diào)焦旋鈕至細(xì)胞清晰。

（5）細(xì)胞增殖測(cè)定。向每個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)加入10 μL MTT溶液（5 mg／mL），在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h。每孔加入100 μL Formazan 溶解液，適當(dāng)混勻，在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)再繼續(xù)孵育，直至在普通光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)紫色結(jié)晶即甲臜全部溶解（溶解時(shí)間與結(jié)晶量有關(guān)，一般為3 ～4 h）。隨后用酶標(biāo)儀在檢測(cè)波長（570 nm）和校正波長（630 nm）下測(cè)定各孔吸光度。

（6）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用SPSS 19 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均用ˉx ±s 表示，組間比較采用單因素方差分析［11］。P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 不同培養(yǎng)條件下3T3-L1 細(xì)胞和L929 細(xì)胞的增殖

在相同細(xì)胞接種量的情況下，接種3 d 后3T3-L1和L929 兩種細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件下的OD 值（OD570-OD空白對(duì)照570平均值-OD630＋ OD空白對(duì)照630平均值）如表4 所示。其中3T3-L1 細(xì)胞在DMEM ＋10%NBCS和DMEM ＋10%FBS培養(yǎng)條件下的OD值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＜0. 05），L929 細(xì)胞在DMEM ＋10% NBCS 和DMEM ＋10%FBS 培養(yǎng)條件下的OD 值無明顯差異。在此實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上可推斷A、B各為哪種細(xì)胞。

表4 接種3d后3T3-L1 和L929 兩種細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件下的OD值

3.2 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

（1）活細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，蓋玻片的邊緣要蓋住計(jì)數(shù)板最外邊的凹槽。蓋玻片和計(jì)數(shù)板之間應(yīng)呈現(xiàn)牛頓環(huán)，這樣蓋玻片才算平整地蓋到計(jì)數(shù)板上，計(jì)數(shù)小室的深度僅為1 mm。往計(jì)數(shù)小室注入的細(xì)胞懸液不要太多，也不要太少，否則由于表面張力的變化會(huì)改變小室的容積，細(xì)胞懸液流到凹槽邊緣即可［10］。

（2）MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖時(shí)，終止培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞數(shù)量不應(yīng)過多，以防影響甲臜產(chǎn)生的量與細(xì)胞數(shù)量間的良好線性關(guān)系（OD 值在0.2 ～0.8 之間誤差較?。?。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，每次實(shí)驗(yàn)均應(yīng)設(shè)置與實(shí)驗(yàn)孔平行的空白對(duì)照，即除了不含細(xì)胞外其他條件相同的對(duì)照孔，最后比色時(shí)以對(duì)照孔調(diào)零。由于使用96 孔板進(jìn)行檢測(cè)，如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長，一定要注意蒸發(fā)的問題，一方面，由于96 孔板周圍1 圈最容易蒸發(fā)，可以采取棄用周圍1 圈的辦法，改加平衡鹽溶液、水或培養(yǎng)液；另一方面，可以把96 孔板置于靠近培養(yǎng)箱內(nèi)水源的地方，以緩解蒸發(fā)。

4 實(shí)驗(yàn)教學(xué)探討

4.1 開設(shè)探究性實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目的意義

細(xì)胞的增殖測(cè)定是具有普適性的細(xì)胞培養(yǎng)核心操作，培養(yǎng)學(xué)生掌握此實(shí)驗(yàn)操作十分必要。傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)，一般采取“老師現(xiàn)場(chǎng)演示講解，學(xué)生依照教材摸索操作”的模式［12］，其教學(xué)效果往往不盡人意，究其原因，大多在于對(duì)學(xué)生學(xué)習(xí)主體地位的漠然以及對(duì)學(xué)生自主學(xué)習(xí)能力培養(yǎng)的忽視［13］。這就導(dǎo)致學(xué)生在習(xí)慣被動(dòng)接受老師知識(shí)的情況下進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，操作停留在對(duì)老師現(xiàn)場(chǎng)演示講解的機(jī)械模仿、對(duì)實(shí)驗(yàn)教材的盲目迷信階段，學(xué)生缺乏主動(dòng)獲取知識(shí)的意識(shí)與能力，這顯然不利于他們掌握實(shí)驗(yàn)技能、鍛煉能力素質(zhì)。該探究式教學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，注重學(xué)生在學(xué)習(xí)過程中的主體地位，在圍繞知識(shí)點(diǎn)所創(chuàng)設(shè)的特定情境之下，通過老師的啟發(fā)、引導(dǎo)與支持，學(xué)生帶著問題開展自主性學(xué)習(xí)［14-16］，從而達(dá)到對(duì)知識(shí)技能的深入理解與掌握，對(duì)綜合素質(zhì)的切實(shí)鍛煉與提高。

4.2 實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的特色

該教學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，將探究式教學(xué)方法應(yīng)用于細(xì)胞的增殖測(cè)定，教學(xué)活動(dòng)的主體由老師轉(zhuǎn)移到學(xué)生，圍繞學(xué)生的自主知識(shí)構(gòu)建，綜合運(yùn)用主動(dòng)學(xué)習(xí)、合作學(xué)習(xí)、探究式學(xué)習(xí)、基于問題的學(xué)習(xí)等多項(xiàng)教學(xué)策略，充分調(diào)動(dòng)學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性和主動(dòng)性，通過培養(yǎng)學(xué)生的專業(yè)技能和綜合能力，促進(jìn)學(xué)生的優(yōu)質(zhì)學(xué)習(xí)和全面發(fā)展。

4.3 實(shí)驗(yàn)安排的可行性

該探究式實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目制定了詳細(xì)的操作流程，并經(jīng)過實(shí)驗(yàn)老師反復(fù)驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性高。實(shí)驗(yàn)中使用的3T3-L1 細(xì)胞和L929 細(xì)胞為常見細(xì)胞株，價(jià)格低廉，且易于培養(yǎng)。涉及的實(shí)驗(yàn)技術(shù)有：無菌技術(shù)、細(xì)胞傳代技術(shù)、倒置顯微鏡的使用、臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞、MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖等細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，一般高校均開設(shè)有相關(guān)的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)課程，可操作性強(qiáng)。

4.4 實(shí)驗(yàn)的推廣與應(yīng)用

能否順利開展此實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，首先要求實(shí)驗(yàn)室具備3T3-L1 細(xì)胞和L929 細(xì)胞，也可參考此文思路，利用已有的細(xì)胞株自行設(shè)計(jì)相關(guān)探究式教學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。其次實(shí)驗(yàn)室需具備細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)的儀器設(shè)備，其中若實(shí)驗(yàn)室未配備酶標(biāo)儀，可根據(jù)現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，修改教學(xué)安排，如改用直接計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞增殖。最后特別要求實(shí)驗(yàn)老師在熟練掌握相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的同時(shí)，能夠有效地啟發(fā)、引導(dǎo)與支持學(xué)生的探究式學(xué)習(xí)。因此，該探究式教學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目可在具備以上條件的高校參考試行。

5 結(jié) 語

該教學(xué)實(shí)驗(yàn)，改變了傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中學(xué)生被動(dòng)消極的學(xué)習(xí)狀態(tài)，使學(xué)生以主動(dòng)積極的姿態(tài)成為學(xué)習(xí)的主體；而老師則由指導(dǎo)變?yōu)橐龑?dǎo)，由講授變?yōu)閱l(fā)，并起總結(jié)深化的作用。這有效解決了傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)存在的諸多問題，變革了傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式，是改進(jìn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的一次全新探索。