靳 明， 景雪拳， 韋麗紅， 白國(guó)義， 楊瑜濤

（河北大學(xué)a.化學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心；b.化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北保定071002）

0 引 言

實(shí)驗(yàn)教學(xué)是高等教育中的重要實(shí)踐教學(xué)環(huán)節(jié)，是培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新能力、實(shí)踐能力和綜合素質(zhì)的重要教學(xué)手段［1-2］?；瘜W(xué)是一門(mén)以實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)的學(xué)科，實(shí)驗(yàn)教學(xué)在學(xué)生培養(yǎng)方案中占有非常高的比例?；瘜W(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)對(duì)于學(xué)生的知識(shí)、能力、思維和素質(zhì)的協(xié)調(diào)發(fā)展起著至關(guān)重要的作用，在整個(gè)化學(xué)教育教學(xué)過(guò)程中占有特殊的地位。傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)是學(xué)生按照教科書(shū)提供的實(shí)驗(yàn)方案，在教師的指導(dǎo)下完成實(shí)驗(yàn)，能夠培養(yǎng)學(xué)生的基本實(shí)驗(yàn)技能，但實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與科研前和實(shí)際應(yīng)用聯(lián)系較少，學(xué)生的創(chuàng)新實(shí)踐能力和綜合能力得不到充分的鍛煉和提高。研究與創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)是集多學(xué)科性、創(chuàng)新性、研究設(shè)計(jì)性和綜合性實(shí)驗(yàn)技能于一體的實(shí)驗(yàn)課程，不僅培養(yǎng)學(xué)生實(shí)驗(yàn)操作技能，關(guān)鍵是縮小學(xué)生所學(xué)專業(yè)基礎(chǔ)知識(shí)與科研、生產(chǎn)實(shí)踐中解決實(shí)際問(wèn)題能力之間的差距，達(dá)到增強(qiáng)學(xué)生科研能力、實(shí)踐能力和創(chuàng)新能力的目標(biāo)。因此，當(dāng)前在高校積極開(kāi)展研究與創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)尤為必要，國(guó)內(nèi)諸多高校也在此思路上進(jìn)行了探索和實(shí)踐［3-12］。

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路

香豆素是一類常見(jiàn)的熒光染料，合成方法簡(jiǎn)便，熒光團(tuán)易于修飾，波長(zhǎng)范圍易于拓展，量子產(chǎn)率高，已廣泛應(yīng)用于熒光探針領(lǐng)域。在前期工作的基礎(chǔ)上［13-15］，利用8-羥基久洛尼定和苯并噻唑的剛性平面結(jié)構(gòu)增強(qiáng)了香豆素的熒光母體探針的平面性，設(shè)計(jì)了一種新的香豆素-苯并噻唑熒光探針，并以此開(kāi)展本科生研究與創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下：①通過(guò)4 步有機(jī)合成反應(yīng)制備探針?lè)肿?，合成路線如圖1 所示。4 個(gè)不同反應(yīng)涉及有機(jī)反應(yīng)中的不同化學(xué)反應(yīng)，學(xué)生可利用已掌握的知識(shí)或是查閱文獻(xiàn)的方式了解其反應(yīng)機(jī)理，利用SciFinder查找反應(yīng)路線，不同組的同學(xué)嘗試不同的反應(yīng)路線，最后對(duì)比了解最佳方式；②對(duì)探針?lè)肿舆M(jìn)行分離、純化與表征；③對(duì)探針?lè)肿拥淖贤夂蜔晒夤庾V性質(zhì)進(jìn)行分析探討。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，學(xué)生不僅學(xué)習(xí)鞏固了有機(jī)化學(xué)和波譜學(xué)理論知識(shí)，學(xué)會(huì)了抽濾、萃取和硅膠色譜柱等有機(jī)化學(xué)基本操作，還掌握了儀器分析化學(xué)中的紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)和熒光光譜儀等儀器的使用和Origin 等數(shù)據(jù)處理方法。另外，此實(shí)驗(yàn)還可以通過(guò)探針溶液前后顏色變化，把實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和光譜的理論知識(shí)結(jié)合起來(lái)，讓學(xué)生更直觀地觀察到實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象變化，教學(xué)效果良好，有利于激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)科研興趣，提高科研創(chuàng)新能力。

圖1 探針?lè)肿拥暮铣陕肪€

2 實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)試劑、儀器

2.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h3>

通過(guò)文獻(xiàn)檢索，學(xué)會(huì)中外數(shù)據(jù)庫(kù)的使用，了解香豆素衍生物熒光探針的研究進(jìn)展、合成方法以及應(yīng)用前景；掌握加熱、過(guò)濾、重結(jié)晶、萃取、柱層析等基礎(chǔ)的合成實(shí)驗(yàn)方法操作和技能；掌握縮合、成環(huán)、鹵化、氧化等經(jīng)典有機(jī)反應(yīng)，并能進(jìn)行一些簡(jiǎn)單的探針設(shè)計(jì)；熟練磁力攪拌器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)和熒光光譜儀等儀器的操作；了解核磁共振儀和質(zhì)譜儀的檢測(cè)原理；學(xué)會(huì)核磁、質(zhì)譜、紫外和熒光等儀器使用及Origin等數(shù)據(jù)處理和圖譜分析方法；培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立分析和解決問(wèn)題的能力，提高學(xué)生的科研創(chuàng)新能力。

2.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

儀器：茄形瓶、磁力攪拌器、油浴盆、層析柱、蛇形冷凝器、錐形瓶、電子天平、循環(huán)水真空泵、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、AVANCE Ⅲ型核磁共振儀（瑞士布魯克），Cary 60型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)安捷倫），Cary Eclipse型熒光光譜儀（美國(guó)安捷倫）。

試劑：苯酚、丙二酸、三氯氧磷、哌啶、甲苯、8-羥基久洛尼定、正己烷、氫氧化鈉、N，N-二甲基甲酰胺（DMF），氯化鈉、乙腈、無(wú)水乙醇、苯并噻唑鹽、無(wú)水硫酸鈉、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、氯仿、二甲基亞砜（DMSO）、丙酮、不同陰離子溶液、GSH、Hcy、Cys。

3 實(shí)驗(yàn)實(shí)施步驟

3.1 化合物2 的合成

在150 mL圓底燒瓶中加入苯酚（10.6 mmol，1.00 g）和丙二酸（5.3 mmol，0.55 g），接著向其中慢慢加入POCl3（6.15 mmol，0.58 mL），在0 ℃下攪拌30 min，慢慢將混合物加熱至120 ℃，直至沒(méi)有HCl氣體生成后，將混合物冷卻至室溫，將反應(yīng)物倒入100 mL 水中，用乙酸乙酯萃取3 次，收集有機(jī)相，加入無(wú)水硫酸鈉干燥后濃縮得到白色固體化合物2（1.12 g，產(chǎn)率87.5%）。

3.2 化合物3 的合成

將化合物2（4 mmol，1.02 g）置于100 mL圓底燒瓶，加入甲苯（10 mL）溶解，接著加入8-羥基久洛尼定（4 mmol，0.75 g），在110 ℃下攪拌回流10 h，冷卻至室溫，過(guò)濾，正己烷洗滌多次得到化合物3（0.94 g，產(chǎn)率91.2%）

3.3 化合物4 的合成

在N2保護(hù)下，將POCl3（3 mL）慢慢滴加到無(wú)水DMF（3 mL）中，室溫?cái)嚢?0 min，得到紅色液體。將紅色溶液逐滴加入到化合物3（3.5 mmol，0.90 g）的DMF（5 mL）溶液中，60 ℃下攪拌10 h后，將反應(yīng)液倒入50 mL 水中，用30%的NaOH 溶液將溶液調(diào)節(jié)至pH ＝5，有大量紅色沉淀產(chǎn)生，過(guò)濾，將粗產(chǎn)品進(jìn)行柱層析分離提純（PE∶EA ＝1∶1）得到紅色固體化合物4（0.76 g，產(chǎn)率72.2%）。

3.4 探針的合成

將化合物4（1. 0 mmol，0. 30 g）和苯并噻唑鹽（1.1 mmol，0.31 mg），用無(wú)水乙醇（25 mL）溶解，加熱回流攪拌12 h，將反應(yīng)液冷卻至室溫，抽濾得到固體，用無(wú)水乙醇充分洗滌，得到探針化合物1（0.37 g，產(chǎn)率83%）。1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ8. 33（d，J ＝7.8 Hz，1H），8.17 ～8.23（m，2H），8.03（d，J ＝15.0 Hz，1H），7.82（t，J ＝15.6 Hz，1H），7.73（t，J ＝15.0 Hz，1H），7.41（s，1H），4.18（s，3H），3.42（d，J ＝5.4 Hz，4H），3.72 ～3.77（m，4H），1.88 ～1.91（m，4H），13C NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ 157.9，151.1，149.9，149.8，146.7，142.1，139.9，129.3，128.1，127.4，124.2，124.1，121.6，116.5，112.9，107. 9，107. 1，104. 9，50. 0，49. 4，35. 9，26.8，20.3，19.5，19.3。

4 結(jié)果與討論

4.1 紫外可見(jiàn)吸收光譜分析

圖2 探針?lè)肿樱?0 μmol／L）對(duì)陰離子及小分子生物硫醇（100 μmol／L）的響應(yīng)的紫外光譜圖

4.2 熒光光譜分析

如圖3 所示，在DMF-PBS（v／v ＝1／10，PBS，10 mmol／L，pH 7.4）緩沖溶液中，利用熒光光譜分析了探針?lè)肿訉?duì)上述分析物的識(shí)別性能。選擇等吸收點(diǎn)470 nm 為激發(fā)波長(zhǎng)，熒光探針在665 nm 處有強(qiáng)的發(fā)射波長(zhǎng)，當(dāng)加入時(shí)，762 nm處熒光減弱，556 nm有強(qiáng)的熒光發(fā)射出現(xiàn)，溶液的熒光顏色由紫紅色變?yōu)榫G色，其他分析物并未發(fā)生明顯變化，結(jié)果表明，熒光探針對(duì)識(shí)別有高選擇性。

圖3 探針?lè)肿?（4 μmol／L）對(duì)陰離子及小分子生物硫醇（40 μmol／L）的響應(yīng)的熒光光譜圖（激發(fā)波長(zhǎng)為470 nm，狹縫：10 nm／10 nm）

圖4 的熒光滴定圖

最后，利用熒光光譜研究了pH 值對(duì)探針?lè)肿幼R(shí)別性能的影響。如圖5 所示，探針?lè)肿釉趐H 3 ～11 范圍內(nèi)，I665nm／I556nm沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明探針?lè)肿佑辛己玫哪退釅A性，比較穩(wěn)定，隨著的加入，發(fā)現(xiàn)I665nm／I556nm在pH 6 ～11 范圍內(nèi)發(fā)生明顯變化，表明探針?lè)肿釉谳^寬的pH 值范圍內(nèi)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)范圍內(nèi)的識(shí)別檢測(cè)。

圖5 pH值對(duì)探針熒光強(qiáng)度的影響

5 結(jié) 語(yǔ)

通過(guò)香豆素—苯并噻唑熒光探針的設(shè)計(jì)、合成及對(duì)亞硫酸氫根的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，學(xué)生掌握了大量的有機(jī)化學(xué)和波譜學(xué)理論知識(shí)，尤其經(jīng)過(guò)最初的設(shè)計(jì)、理論論證、實(shí)踐實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)反饋、再次理論指導(dǎo)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)再檢驗(yàn)等理論實(shí)踐相互交替輪流驗(yàn)證中，學(xué)生理論知識(shí)得到進(jìn)一步提高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果又進(jìn)一步驗(yàn)證理論知識(shí)，提高了分析問(wèn)題解決問(wèn)題的能力。通過(guò)不斷地實(shí)驗(yàn)和儀器的使用及數(shù)據(jù)的處理，增強(qiáng)了學(xué)生的動(dòng)手能力。查找諸多有機(jī)反應(yīng)機(jī)理，更是讓學(xué)生親身體會(huì)到理論到實(shí)際再到理論的過(guò)程。

近年來(lái)，受該實(shí)驗(yàn)啟發(fā)，學(xué)生求知欲和自主探究問(wèn)題能力增強(qiáng)。作為本科生，設(shè)計(jì)了諸多新穎熒光探針，如識(shí)別室內(nèi)甲醛、環(huán)境中硫化物、水中重金屬離子和生物體內(nèi)小分子硫醇等，并多次成功申請(qǐng)到大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目、實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放項(xiàng)目及發(fā)表科研論文［15-16］，提高了學(xué)生的科研能力和創(chuàng)新能力。