楊全偉,張耕,胡松
(武漢市第一醫(yī)院藥學部,武漢 430022)
活血祛瘀巴布劑由丹參、骨碎補、赤芍、五加皮、牡丹皮、紅花、甘草等7味中藥組成,為我院中醫(yī)科臨床使用多年的協(xié)定處方,目前臨床應用時將其處方飲片藥材打粉,蜂蜜調(diào)和,貼敷,臨床療效確切,深受患者認可。筆者在本實驗考察活血祛瘀巴布劑透皮性能,選擇君藥丹參中丹參素鈉、原兒茶醛、阿魏酸、迷迭香酸以及丹酚酸B 5種主要有效成分為檢測指標,考察其體外釋放度、離體透皮率及制備的巴布劑動力學釋放行為,現(xiàn)報道如下。
1.1儀器 ME215S電子分析天平(Sartorius公司,Max210 g,d=0.01 mg);Essentia LC-16高效液相色譜儀(日本島津公司,自動進樣器,紫外檢測器:SPD-20A);RYJ-6A型藥物透皮擴散試驗儀(上海黃海藥檢儀器廠);超純水機(上?;莘挚茖W分析儀器有限公司);KQ-300DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。
1.3實驗動物 清潔級小鼠,體質(zhì)量(20±5)g,由湖北省疾病預防控制中心動物實驗室提供,實驗動物合格證號:NO.4200695787,實驗動物許可證號:SCXK(鄂)2019-0030。屏蔽環(huán)境飼養(yǎng),普通維持飼料,自由飲水。室溫(22±3) ℃,相對濕度(55±5)%,12 h光照黑暗循環(huán)。
2.1色譜條件 色譜柱C18分析柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈(A)-0.1%磷酸(B),采用梯度洗脫方法,具體洗脫流程見表1;流速:1.0 mL·min-1;進樣量:10 μL;柱溫30 ℃;檢測波長287 nm。
表1 梯度洗脫程序
2.2樣品的制備
2.2.1對照品溶液 精密稱取各對照品,置5個50 mL量瓶,70%甲醇溶解,制成丹參素鈉、原兒茶醛、阿魏酸、迷迭香酸和丹酚酸B含量分別為0.108,0.1026,0.1248,0.1516,0.1646 mg·mL-1貯備液,精密量取上述5個對照品溶液5 mL,置50 mL量瓶,加70%甲醇定容至刻度,搖勻,過濾,即為混合對照品溶液。
2.2.2供試品溶液 按活血祛瘀巴布劑處方稱取藥材,加30%乙醇滲漉提取,所得藥液減壓濃縮成流浸膏,備用。稱取聚丙烯酸鈉,加甘油攪拌溶解,加入活血祛瘀巴布劑流浸膏,加入明膠膠體液溶脹,加入氮酮,攪拌熟化,攤涂。晾干,按規(guī)格切割成片,密封袋保存。
取活血祛瘀巴布劑一貼(批號:19081501),除去蓋襯,取膏體約0.4 g,精密稱定,置100 mL錐形瓶,密封,精密加入60%乙醇50 mL,稱質(zhì)量,超聲處理15 min(120 W,頻率40 kHz),放冷,用60%乙醇補質(zhì)量,過濾,取續(xù)濾液,即為供試品溶液。
2.2.3陰性溶液 按活血祛瘀巴布劑處方,稱取除丹參外的其他藥材,按“2.2.2”項供試品溶液制備方法制備,過濾,續(xù)濾液即為陰性溶液。
漢英學習型詞典形容詞條目譯義語境化描寫 ……………………………………………………… 秦 曦(5.34)
2.3方法學考察
2.3.1專屬性考察 按“2.1”項色譜條件,分別取混合對照品溶液(丹參素鈉、原兒茶醛、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B對照品濃度分別為0.010 8,0.010 26,0.012 48,0.015 16,0.016 46 mg·mL-1)、供試品溶液、陰性溶液,分別進樣10 μL檢測,得色譜圖,見圖1。由圖1可見,供試品各指標組分與對照品組分保持一致,同時組分間均可以實現(xiàn)很好分離,分離度大于1.5,理論塔板數(shù)大于3000,陰性樣品無干擾。
1.丹參素鈉;2.原兒茶醛;3.阿魏酸;4.迷迭香酸;5.丹酚酸B。
2.3.2線性關系考察 分別取“2.2.1”項5個對照品貯備液,按“2.1”項色譜條件,分別進樣1,2,4,8,10,20 μL,記錄峰面積,以進樣含量為橫坐標(X),以峰面積為縱坐標(Y),分別計算線性回歸方程,結果見表2,各組分在其范圍內(nèi)線性關系符合標準。
表2 各組分線性關系
2.3.3精密度實驗 取“2.2.1”項混合對照品溶液,按“2.1”項色譜條件,連續(xù)進樣6次,每次進樣10 μL,計算得丹參素鈉、原兒茶醛、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B峰面積RSD分別為0.23%,0.72%,0.89%,1.04%,1.15%,表明儀器精密度良好。
2.3.4穩(wěn)定性實驗 取活血祛瘀巴布劑一貼(批號:19081501),除去蓋襯,取膏體約0.4 g,精密稱定,置100 mL錐形瓶,密封,精密加入60%乙醇50 mL,稱質(zhì)量,超聲處理15 min(120 W,頻率40 kHz),放冷,稱質(zhì)量,加60%乙醇補充質(zhì)量,過濾,取續(xù)濾液,按“2.1”項色譜條件,分別于1,2,4,8,12,24 h進樣10 μL,計算6個時間點丹參素鈉、原兒茶醛、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B含量,與0 h樣品含量進行比較,計算得RSD<1%,說明樣品24 h基本無降解; 5種組分峰面積RSD分別為1.27%,1.44%,0.96%,1.36%,1.75%,表明溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.3.5重復性實驗 取活血祛瘀巴布劑(批號:19081501),除去蓋襯,取6份膏體,每份約0.4 g,精密稱定,按“2.2.2”項供試品溶液制備方法制備,在“2.1”項色譜條件下分別進樣10 μL,計算得丹參素鈉、原兒茶醛、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B含量分別為212.39,132.532,373.04,408.044,554.42 μg,RSD分別為1.83%,1.90%,1.99%,1.48%,1.20%,表明該方法重復性良好。
2.3.6加樣回收率實驗 見表3。取活血祛瘀巴布劑(批號:19081501),除去蓋襯,分別稱取6份膏體,每份約0.2 g,精密稱定,分別加入丹參素鈉、原兒茶醛、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B混合對照品溶液適量,按“2.2.2”項供試品溶液制備方法制備,在“2.1”項色譜條件下,分別進樣10 μL,計算丹參素鈉、原兒茶醛、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B含量,計算加樣回收率,結果RSD分別為1.17%(n=6)、1.28%(n=6)、1.02%(n=6)、0.38(n=6)、0.68%(n=6),表明該實驗結果良好,數(shù)據(jù)可靠,方法可行。
表3 6種成分加樣回收率實驗結果
2.4樣品含量測定 取活血祛瘀巴布劑3批(批號:19081501,19081502,19081503),按“2.2.2”項供試品溶液制備方法制備,按“2.1”項色譜條件,分別進樣10 μL,測定丹參素鈉、原兒茶醛、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B含量,結果見表4。
表4 樣品含量測定結果
2.5釋放度實驗 按2015年版《中華人民共和國藥典》(四部)項下通則0931關于溶出度與釋放度測定法第四法槳碟法進行操作[1-2]:取不銹鋼篩網(wǎng)(孔徑2 mm×2 mm)制成2個網(wǎng)碟,精確稱取活血祛瘀巴布劑0.4 g,將其用2個網(wǎng)碟固定,同時使巴布劑藥面朝上,置于500 mL燒杯中部,加入37 ℃0.9%氯化鈉溶液500 mL,保持恒溫,用攪拌槳勻速攪拌,分別于30,60,90,120,150,180 min精密吸取溶液100 mL,取樣后再分別注入37 ℃0.9%氯化鈉溶液100 mL。
2.5.1供試品溶液的制備 分別將6個時間段接收液分別置水浴鍋蒸干,用60%甲醇溶液溶解,轉(zhuǎn)移至1 mL量瓶,并定容至刻度、搖勻,過濾,取續(xù)濾液即得。
2.5.2釋放度測定結果 將上述6個時間段制備的樣品溶液,按照上述“2.1”項色譜條件,分別進樣10 μL,記錄峰面積,計算釋放含量,結果見圖2。
圖2 活血祛瘀巴布劑離體釋放度實驗結果
2.6離體小鼠透皮率測定 取清潔級小鼠,脫頸處死,電動剃刀將腹部脫毛,脫毛過程中不損害外部皮膚,酒精消毒,從腹部剪開皮膚,0.9%氯化鈉溶液清洗[3-5]。采用改良Franz擴散池,將腹部鼠皮朝下,腹部內(nèi)皮層朝上,置于接收池上,稱取活血祛瘀巴布劑0.40 g,精密稱定,貼敷于老鼠皮部,將接收池內(nèi)加滿0.9%氯化鈉溶液,水浴恒溫保持(37±1)℃,開啟磁力攪拌(攪拌速度200 r·min-1),分別于1,2,4,8,12,24 h,取出接收池中接收液,同時補充同量恒溫0.9%氯化鈉溶液(37±1 ℃)。
2.6.1活血祛瘀巴布劑透皮供試品溶液的制備 分別將6個時間段的接收液置水浴鍋蒸干,60%甲醇溶解,轉(zhuǎn)移至1 mL量瓶,并定容至刻度、搖勻,過濾,取續(xù)濾液即得。
2.6.2離體透皮率含量測定 將上述制備的樣品,按“2.1”項色譜條件注入高效液相色譜儀,分別進樣10 μL檢測,計算樣品中丹參素鈉、原兒茶醛、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B含量及經(jīng)皮滲透動力學擬合,活血祛瘀巴布劑(0.400 0 g)中含有丹參素鈉212.923 μg、原兒茶醛132.532 μg、阿魏酸373.204 μg、迷迭香酸408.044 μg、丹酚酸B554.42 μg,結果見圖3和表5。
圖3 活血祛瘀巴布劑中丹參素鈉、原兒茶醛、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B累積透皮量-時間變化曲線
2.7結果 由表5結果可知,活血祛瘀巴布劑中丹參素鈉經(jīng)皮滲透動力學擬合方程符合Higuchi方程,擬合度為0.934;原兒茶醛透皮動力學擬合方程中,擬合度最高為0.943,符合Higuchi方程;阿魏酸經(jīng)皮滲透動力學擬合方程中,符合Higuchi方程,擬合度為0.973;迷迭香酸經(jīng)皮滲透動力學擬合方程中,符合Higuchi方程,擬合度為0.961;丹酚酸B動力學擬合方程中,擬合度最高為0.975,符合Higuchi方程。
由圖5結果可知,活血祛瘀巴布劑中離體小鼠透皮率,5種有效組分含量均為逐步緩慢釋放,在皮膚角質(zhì)層進行貯庫蓄積,從而進行低速運輸,表明該制劑為骨架型緩釋制劑[6-7]。
表5 經(jīng)皮滲透動力學擬合方程
活血祛瘀巴布劑具有行氣活血化瘀、通絡止痛的功效。本實驗選擇丹參中水溶性有效成分丹參素鈉、原兒茶醛、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B進行含量測定,考察指標成分均對骨疾病有良好藥理功效,其中丹參素鈉具有抑制破骨細胞成熟和活化,減少骨組織吸收、破壞[8],上皮分化因子通過骨保護素和核因子-κB活化受體配體調(diào)控破骨細胞;原兒茶醛能明顯改善模型動物骨物理指標,增加骨密度、骨礦物質(zhì)和有機質(zhì),增強各重要器官質(zhì)量比(器官質(zhì)量/體質(zhì)量),從而有效防治醋酸潑尼松所致骨質(zhì)疏松[9];阿魏酸可以在骨折愈合初期血腫機化期,通過加快微循環(huán)血流速度,增加毛細血管網(wǎng)的通透性,改善骨折斷端局部血液循環(huán),清除血凝塊及代謝產(chǎn)物,促進骨折愈合[10];迷迭香酸通過線粒體途徑誘導線粒體產(chǎn)生細胞色素C,引起激活T細胞凋亡[11];丹酚酸B可用于防治糖皮質(zhì)激素所致松質(zhì)骨骨量丟失,有效抑制人骨髓間充質(zhì)干細胞分化、礦化[12]。
對所考察的含量測定指標成分,通過紫外分光光度儀進行最佳波長選擇,發(fā)現(xiàn)吸收波長為287 nm時,各組分均有良好響應吸收峰,故確定最佳吸收波長為287 nm。選擇流動相時,考察了甲醇-0.1%磷酸,乙腈-0.1%磷酸,甲醇-0.1%醋酸等不同流動相系統(tǒng)進行洗脫,采用乙腈-0.1%磷酸時,峰形較好,采用該流動相進行梯度條件的篩選,最終確定最佳梯度洗脫流動相。
筆者在本實驗制備的巴布劑通過釋藥動學擬合,發(fā)現(xiàn)該藥為骨架型透皮制劑,骨架型透皮吸收制劑是藥物分散在聚合物骨架中,由骨架的組成成分來控制藥物的釋放。骨架型透皮貼比貯庫型更薄更小,而且皮膚刺激性小,因此患者的順應性更好,為目前藥物經(jīng)皮領域研究的熱點[13]。巴布劑中有效成分的釋放較為緩慢、平穩(wěn),從而可有效地避免血藥濃度的明顯波動,減少血藥濃度“峰谷”現(xiàn)象,減少患者因血藥濃度過高而發(fā)生的不良反應。制備的活血祛瘀巴布劑緩控釋制劑可實現(xiàn)藥物釋放的定時、定位、定速,從而可使藥物發(fā)揮出更好的療效。