樊玉祥， 曾凡業(yè)， 張洪亮

(新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院腫瘤二科， 新疆 烏魯木齊 830000)

胃癌是最常見(jiàn)的消化道腫瘤之一，也是我國(guó)第二高發(fā)腫瘤，中國(guó)胃癌發(fā)病例數(shù)和死亡例數(shù)分別占全球胃癌發(fā)病和死亡的42.6%和45.0%，在全球183個(gè)國(guó)家中位于發(fā)病率第5位、死亡率第6位，并且胃癌死亡率將持續(xù)上升[1]。傳統(tǒng)胃癌治療手段包括手術(shù)、化療和放療，而放、化療過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)不同程度的毒副作用。因此，尋找低毒高效的抗腫瘤藥物是目前熱點(diǎn)的研究方向。β咔啉類生物堿對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901有誘導(dǎo)凋亡的作用，部分體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明β咔啉類生物堿可使人胃癌細(xì)胞SGC-7901荷瘤小鼠腫瘤組織瘤重減輕[2,3]，但其機(jī)制尚不明確。為了驗(yàn)證從駱駝蓬提取的β咔啉類生物堿對(duì)胃癌的治療作用，采取SGC-7901胃癌細(xì)胞建立皮下移植瘤小鼠模型，研究β咔啉類生物堿對(duì)荷瘤小鼠的抑瘤作用，并從分子生物學(xué)角度探索β咔啉類生物堿抗胃癌的作用機(jī)制，為臨床進(jìn)一步運(yùn)用β咔啉類生物堿治療胃癌提供研究方向。

1 資料與方法

1.1一般資料:昆明小鼠50只，SPF級(jí)飼養(yǎng)，雌雄對(duì)半，體重18.0±3.1g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(新)2016-0003。SGC-7901細(xì)胞購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；β咔啉類生物堿由北京中醫(yī)藥大學(xué)劉永剛教授鑒定；人胃癌SGC-7901細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)；氟尿嘧啶購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液及胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；蘇木精-伊紅染色液購(gòu)自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司；TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物科技有限公司；BCA定量試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；BCL-2、Bax、FAK、PI3K、AKT、mTOR抗體購(gòu)買(mǎi)自Cell Signaling公司。

1.2方 法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng):按常規(guī)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)方法按時(shí)還液、傳代。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞調(diào)整至備用狀態(tài)。

1.2.2動(dòng)物模型制備:荷瘤小鼠在SPF環(huán)境飼養(yǎng)一周。按數(shù)字表法隨機(jī)分為5組，空白對(duì)照組，陽(yáng)性藥物組(氟尿嘧啶組)，β-咔啉類生物堿低、中、高劑量組，每組10只。各組腹腔注射環(huán)磷酰胺，連續(xù)7d，然后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞使用RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整至細(xì)胞密度為1×107/mL，將0.2mL細(xì)胞混懸液接種于小鼠背部。陽(yáng)性藥物組腹腔注射氟尿嘧啶267mg/kg，連續(xù)2d，空白對(duì)照組腹腔注射生理鹽水1mL，連續(xù)14d。β-咔啉類生物堿低、中、高劑量組分別使用2.5mg、5mg、7.5mg/kg口服給藥，連續(xù)14d。接種10d后，使用超聲探查接種處，皮下有不均勻回聲考慮接種成功。給藥過(guò)程中對(duì)小鼠稱重，并觀察精神狀態(tài)、活動(dòng)、飲食等一般情況。第21天處死所有小鼠，并按要求留取標(biāo)本。

1.2.3腫瘤質(zhì)量的測(cè)定及抑瘤率計(jì)算:實(shí)驗(yàn)第21天使用頸椎脫臼法處死所有小鼠。剝離瘤體，使用電子天平稱取瘤組織重量。使用以下公式計(jì)算抑瘤率：抑瘤率=(模型組平均瘤質(zhì)量-給藥組平均瘤質(zhì)量)/模型組平均瘤質(zhì)量

1.2.4HE染色觀察瘤體組織:將標(biāo)本用10%多聚甲醛固定包埋脫水處理，做成石蠟切片。依次加入不同濃度二甲苯、乙醇中處理，先使用蘇木素處理，再使用伊紅處理，其后使用無(wú)水乙醇、二甲苯中處理，最后使用樹(shù)脂封片，上鏡觀察。

1.2.5TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡:將標(biāo)本使用10%多聚甲醛固定包埋脫水處理，切成5mm切片。加0.01M TBS 1∶200新鮮稀釋Proteinase K 37℃消化，使用TdT和DIG-d-UTP后使用TBS洗片，加封閉液，用抗體稀釋液1：100稀釋生物素化抗地高辛抗體，稀釋SABC后使用DAB顯色，其后使用蘇木素輕度復(fù)染后封片。上鏡觀察，細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為凋亡細(xì)胞。

1.2.6免疫組化染色技術(shù)檢測(cè)瘤體組織BCL-2、Bax、FAK、PI3K、AKT及mTOR的表達(dá):將標(biāo)本使用10%多聚甲醛固定包埋脫水處理，處理成5mm切片。使用相應(yīng)抗體孵育并洗滌、DAB顯色后上鏡觀察。每個(gè)切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，細(xì)胞漿顯示棕黃色的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞。

1.2.7RT-PCR檢測(cè)腫瘤組織中BCL-2、Bax、FAK、PI3K、AKT及mTOR的mRNA的表達(dá):收集經(jīng)β-咔啉類生物堿處理24h的SGC-7901腫瘤瘤體組織，按RT-PCR試劑盒要求進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，然后再進(jìn)行擴(kuò)增。BCL-2的擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，30個(gè)循環(huán)；Bax的擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，28個(gè)循環(huán)；FAK的擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性2min，94℃變性40s，46℃退火40s，72℃延伸1min，28個(gè)循環(huán)；PI3K的擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，55℃退火50s，72℃延伸40s，30個(gè)循環(huán)；AKT的擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3min，94℃變性40s，59℃退火30s，72℃延伸1min，28個(gè)循環(huán)；mTOR的擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，46℃退火40s，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)；β-actin的擴(kuò)增：94℃預(yù)變性4min，94℃變性1min，58℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物4μL于質(zhì)量濃度為1.5%的瓊脂凝膠進(jìn)行電泳，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參基因，使用2-△△CT法計(jì)算基因表達(dá)的相對(duì)變化值，實(shí)驗(yàn)中所用引物序列，見(jiàn)表1。

表1 檢測(cè)引物序列

1.2.8Western blot技術(shù)檢測(cè)腫瘤組織中BCL-2、Bax、FAK、PI3K、AKT及mTOR蛋白的表達(dá):β咔啉類生物堿處理24h的SGC-7901腫瘤組織，經(jīng)液氮研磨之后，收集上清液后測(cè)定蛋白含量，電泳，轉(zhuǎn)膜，分別加入BCL-2、Bax、FAK、PI3K、AKT及mTOR一抗(BCL-2、Bax為1：600，F(xiàn)AK為1：400，PI3K、AKT、mTOR為1：800)，室溫孵育，二抗孵育，封閉，TBST反復(fù)漂洗，顯色后用ChemiScope mini化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)并拍照用，β-actin為內(nèi)參蛋白，進(jìn)行相對(duì)定量表達(dá)檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1小鼠一般情況:本實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制免疫缺陷動(dòng)物模型。除β咔啉類生物堿高劑量組有一只死亡外，其余組均無(wú)死亡。各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)明顯拒食、腹瀉等現(xiàn)象。

表2 各組瘤體重量與成瘤率的比較

2.2瘤重及抑瘤率:β咔啉類生物堿高劑量組的瘤重明顯低于空白對(duì)照組(t=4.539，P=0.000)，高劑量組的瘤重明顯低于低劑量組(t=2.163，P=0.025)，高劑量組與中劑量組的瘤重?zé)o顯著差異(t=0.356，P=0.756)；高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組的瘤重也無(wú)顯著差異(t=0.418，P=0.613)；β咔啉類生物堿中劑量組的瘤重明顯低于空白對(duì)照組(t=3.398，P=0.003)，中劑量組的瘤重又顯著低于低劑量組(t=2.057，P=0.037)；β咔啉類生物堿低劑量組與空白對(duì)照組的瘤重?zé)o顯著差異(t=0.243，P=0.836)；陽(yáng)性對(duì)照組的瘤重明顯低于空白對(duì)照組(t=4.472，P=0.002)，陽(yáng)性對(duì)照組的瘤重明顯低于低劑量組(t=2.163，P=0.021)；以上結(jié)果說(shuō)明與空白對(duì)照組相比，β咔啉類生物堿中劑量組、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組的瘤重均減小(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

2.3β咔啉類生物堿對(duì)胃癌組織病理變化的影響：空白對(duì)照組瘤細(xì)胞體積大小不一，密度大、深染，異型性明顯，浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，周邊部瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活躍；陽(yáng)性對(duì)照組瘤細(xì)胞彌漫排列，異型性明顯，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)較明顯，部分瘤細(xì)胞退變、壞死，染色較深；低劑量組瘤細(xì)胞排列整齊，僅有少量的癌細(xì)胞壞死，染色較淺；中劑量組瘤細(xì)胞排列呈巢團(tuán)狀，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)較輕，瘤細(xì)胞部分異型性明顯，部分壞死；高劑量組瘤細(xì)胞排列呈巢團(tuán)狀，淋巴細(xì)胞聚集浸潤(rùn)，瘤細(xì)胞異型性明顯，大量退變、壞死。這些結(jié)果表明β咔啉類生物堿具有很強(qiáng)的抑瘤作用，見(jiàn)圖1。

圖1 β咔啉類生物堿對(duì)胃癌組織病理學(xué)變化的影響

2.4β咔啉類生物堿對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響:棕黃色為凋亡細(xì)胞，藍(lán)色為陰性細(xì)胞。從圖中可以看出，空白對(duì)照組腫瘤細(xì)胞凋亡最少；陽(yáng)性組和低劑量組有部分凋亡細(xì)胞；中劑量和高劑量處理后，腫瘤凋亡細(xì)胞的數(shù)量明顯增多，凋亡細(xì)胞數(shù)量高于空白對(duì)照組和陽(yáng)性組。結(jié)果表明β咔啉類生物堿中劑量和高劑量可以通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抑瘤作用，見(jiàn)圖2。

圖2 β咔啉類生物堿對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響

2.5β咔啉類生物堿對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響:陽(yáng)性細(xì)胞為棕色顆粒。與空白組相比，β咔啉類生物堿低劑量組中BCL-2、Bax、FAK、PI3K、AKT及mTOR無(wú)顯著差異；與空白組相比，陽(yáng)性組、中劑量組和高劑量組的BCL-2、FAK、PI3K、AKT及mTOR表達(dá)顯著下降，Bax蛋白顯著上升，陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多；與低劑量組相比，陽(yáng)性對(duì)照組、中劑量組和高劑量的BCL-2、FAK、PI3K、AKT及mTOR表達(dá)進(jìn)一步下降，Bax蛋白進(jìn)一步上升，見(jiàn)圖3。

圖3 β咔啉類生物堿對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.6Western blot分析:如表3和圖4所示，與空白對(duì)照組相比，β咔啉類生物堿低劑量組中BCL-2、Bax、FAK、PI3K、AKT及mTOR表達(dá)水平無(wú)顯著差異；與空白對(duì)照組相比，陽(yáng)性組、中劑量組和高劑量組中Bax蛋白表達(dá)顯著提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.219、12.579、15.173，均P<0.01)，BCL-2(t=10.613、9.345、11.527)、FAK(t=11.287、10.982、13.664)、PI3K(t=18.241、16.793、19.217)、AKT(t=13.358、10.284、13.962)及mTOR(t=8.218、6.612、9.054)蛋白表達(dá)顯著下降(均P<0.01)；與低劑量組相比，陽(yáng)性組、中劑量組和高劑量組的Bax蛋白表達(dá)進(jìn)一步上升(t=4.213、3.216、2.614，均P<0.05)，BCL-2(t=5.129、3.256、4.218)、FAK(t=3.276、4.123、5.016)、PI3K(t=3.205、6.651、3.254)、AKT(t=4.164、3.217、5.027)及mTOR(t=4.327、3.275、4.761)蛋白表達(dá)進(jìn)一步下降(均P<0.05)。這些結(jié)果都與免疫組化分析結(jié)果一致，見(jiàn)表3、圖4。

圖4 β咔啉類生物堿對(duì)胃瘤組織中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表3 β咔啉類生物堿對(duì)胃瘤組織中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.7β咔啉類生物堿對(duì)腫瘤組織相關(guān)基因表達(dá)的影響:與空白組相比，β咔啉類生物堿低劑量組中BCL-2、Bax、FAK、PI3K、AKT及mTOR的的mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著差異；與空白對(duì)照組相比，陽(yáng)性組、中劑量組和高劑量組中Bax蛋白的mRNA表達(dá)顯著上升(t=15.163、13.218、17.895，均P<0.01)，BCL-2(t=20.916、11.785、22.164)、FAK(12.183、10.126、15.871)PI3K(t=16.927、13.252、14.913)、AKT(t=12.123、10.942、14.428)、及mTOR(t=16.927、13.252、14.913)蛋白的mRNA表達(dá)顯著下降(均P<0.01)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與低劑量組相比，陽(yáng)性組、中劑量組和高劑量組的Bax蛋白的mRNA表達(dá)進(jìn)一步升高(t=3.125、3.421、4.013，均P<0.05)，BCL-2(t=6.342、5.345、4.165)、FAK(t=4.328、5.329、6.021)、PI3K(t=4.327、5.321、3.828)、AKT(t=4.326、6.327、3.421)及mTOR(t=4.327、5.424、5.189)蛋白的mRNA表達(dá)進(jìn)一步降低(均P<0.05)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該趨勢(shì)與上述蛋白結(jié)果一致，見(jiàn)表4。

表4 β咔啉類生物堿對(duì)胃瘤組織中相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討 論

駱駝蓬喜生于路旁、平原、戈壁等干旱處，具有助陽(yáng)化氣、祛濕散寒之功效。研究結(jié)果表明，其有效成分去氫駱駝蓬堿對(duì)腫瘤細(xì)胞有明顯抑制作用[4]。通過(guò)前期的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)得知，β咔啉類生物堿有一定抗腫瘤作用，主要表現(xiàn)在誘導(dǎo)凋亡、影響細(xì)胞增殖等方面[5]。而腫瘤的發(fā)生發(fā)展與“血管再生理論”密切相關(guān)[6]。β咔啉類生物堿對(duì)血管再生相關(guān)FAK/PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路有何影響報(bào)道較少。本研究從細(xì)胞、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)層面，運(yùn)用分子生物學(xué)手段，研究β咔啉類生物堿對(duì)FAK/PI3K/AKT/mTOM通路的影響，闡明β咔啉類生物堿抗胃癌的作用機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)β咔啉類生物堿中劑量和高劑量治療后，小鼠瘤體重量顯著降低，提示β咔啉類生物堿可以通過(guò)抑制瘤體的生長(zhǎng)，從而發(fā)揮抗胃癌作用，其效果明顯優(yōu)于β咔啉類生物堿低劑量組。HE和TUNEL染色是評(píng)價(jià)胃癌病變組織和凋亡的重要指標(biāo)，結(jié)果表明，β咔啉類生物堿中劑量組和高劑量組能破壞胃癌細(xì)胞組織，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡，其效果隨著β咔啉類生物堿劑量的增大而增強(qiáng)，進(jìn)一步說(shuō)明β咔啉類生物堿抗胃癌機(jī)制可能與破壞胃癌細(xì)胞組織，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡有關(guān)。

細(xì)胞凋亡在腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移及粘附過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。其中促凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl-2，是凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在腫瘤細(xì)胞中，Bcl-2過(guò)表達(dá)與Bax形成異二聚體，發(fā)揮抑制凋亡作用。本研究中采用免疫組化、Western blot和RT-PCR研究結(jié)果表明，β咔啉類生物堿中劑量和高劑量組干預(yù)后瘤體內(nèi)中Bax蛋白有較高的表達(dá)，而B(niǎo)cl-2表達(dá)顯著降低，效果優(yōu)于β咔啉類生物堿低劑量組。結(jié)果表明，β咔啉類生物堿通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達(dá)，促進(jìn)Bax蛋白形成同源二聚體，從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。這可能是β咔啉類生物堿抗胃癌的作用機(jī)制之一。

粘著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)是一種細(xì)胞質(zhì)酪氨酸激酶，高水平的FAK誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，并且與胃癌的不良反應(yīng)相關(guān)[7]。研究結(jié)果表明，F(xiàn)AK的高表達(dá)可以抑制胃癌細(xì)胞的粘附和遷移能力。磷酸酰肌醇3激酶/蛋白激酶B( phosphoinositide 3 kinase / protein kinase B，PI3K/AKT)信號(hào)通路主要參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡等細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程[8]。PI3K是一種磷脂酰肌醇蛋白激酶，與AKT蛋白的Ser308位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，從而導(dǎo)致AKT蛋白的激活?；罨蟮腁KT磷酸化激活下游蛋白mTOR[9]。mTOR主要參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期、增殖和凋亡的過(guò)程，在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡之間發(fā)揮著重要的作用[10]。本研究結(jié)果表明，β咔啉類生物堿中劑量組和高劑量組處理后，腫瘤細(xì)胞內(nèi)FAK和BCL-2蛋白表達(dá)顯著地下降，而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)升高，其效果優(yōu)于β咔啉類生物堿低劑量組。表明FAK主要參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程。同時(shí)PI3K和AKT作為FAK的下游蛋白，PI3K和AKT蛋白的表達(dá)也顯著下降。結(jié)果表明，β咔啉類生物堿通過(guò)激活FAK/PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路來(lái)抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)。

綜上所述，β咔啉類生物堿能顯著抑制移植瘤體生長(zhǎng)，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡，其作用機(jī)制可通過(guò)提高Bax蛋白表達(dá)，降低FAK、PI3K、AKT、mTOR、BCL-2、和Bax蛋白表達(dá)有關(guān)。此次實(shí)驗(yàn)與血管新生的相關(guān)MAPK/ERK通路及VEGF相關(guān)蛋白尚未研究，本課題組將在今后的實(shí)驗(yàn)中做進(jìn)一步深入研究，探討β咔啉類生物堿抗腫瘤血管再生的分子機(jī)制。