唐榮彬， 王 剛

(大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院腫瘤科， 遼寧 大連 116001)

我國(guó)自2010年來(lái)，癌癥已取代心血管疾病成為主要的死亡原因，其中肺癌的發(fā)病率和死亡率高居首位，2014年我國(guó)肺癌發(fā)病率為57.13/10萬(wàn)，死亡率為45.80/10萬(wàn)[1]。早期肺癌臨床表現(xiàn)無(wú)明顯特異性，大部分患者確診為肺癌時(shí)往往已進(jìn)入中晚期。因此，肺癌的早期篩查對(duì)于其治療及預(yù)后有重要的臨床意義。根據(jù)其組織學(xué)特點(diǎn)，肺癌可以分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中80%的肺癌均為NSCLC，而NSCLC又以腺癌較為常見(jiàn)。大量數(shù)據(jù)表明[2,3]，腫瘤的局部進(jìn)展、復(fù)發(fā)以及轉(zhuǎn)移是預(yù)后不良的主要原因。長(zhǎng)鏈非編碼 RNA(long non-coding RNAs，lnc RNAs)是體內(nèi)不參與蛋白編碼的一類長(zhǎng)鏈RNA分子，研究發(fā)現(xiàn)lnc RNAs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有重要的調(diào)控作用。lnc RNA CCHE1(cervical carcinoma high-expressed 1，CCHE1)是一個(gè)新近鑒定一種lnc RNA，Yang M等[4]在宮頸癌組織中進(jìn)行l(wèi)nc RNA篩查，發(fā)現(xiàn)一種高表達(dá)lnc RNA(定義為lnc RNA CCHE1)，其表達(dá)與患者臨床病理特征密切相關(guān)，可預(yù)測(cè)宮頸癌患者預(yù)后，其在宮頸癌中表現(xiàn)出促癌作用。近期研究發(fā)現(xiàn)，lnc RNA CCHE1可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲，對(duì)非小細(xì)胞癌的預(yù)后有一定預(yù)測(cè)作用[5]。但國(guó)內(nèi)關(guān)于lnc RNA CCHE1和肺腺癌的報(bào)道較少，故本研究旨在觀察lnc RNA CCHE1在肺腺癌中的表達(dá)情況，并分析其表達(dá)與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，為肺腺癌的早期診斷、治療及預(yù)后判斷提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取2015年12月至2016年12月行手術(shù)切除的肺腺癌患者83例，收集其肺癌組織和癌旁正常組織蠟塊，肺癌組織經(jīng)病理檢測(cè)確診，癌旁正常組織距離病灶>5cm。其中男45例，女38例；年齡35～79歲，平均年齡(58.26±7.45)歲；TNM分期：Ⅰ期25例，Ⅱ期13例，Ⅲ期39例，Ⅳ期6例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例；分化程度：高分化29例，中分化34例，低分化20例。本研究已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，且患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2方 法

1.2.1qRT-PCR法檢測(cè)lnc RNA CCHE1的表達(dá)：取適量肺癌組織和癌旁正常組織，加入Trizol裂解液(美國(guó)Invitrogen公司)，室溫下勻漿；采用氯仿-異丙醇體系提取其總RNA，測(cè)定其純度、濃度及完整度；參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)GeneCopoeia公司)說(shuō)明書，將提取總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA鏈；取等量cDNA模板，混入SYBR Green PCR Master Mix(美國(guó)Thermo Scientific公司)上qRT-PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)進(jìn)行檢測(cè)，采用2-ΔΔCT法，以GADPH的表達(dá)為內(nèi)參，計(jì)算組織標(biāo)本中l(wèi)nc RNA CCHE1的相對(duì)表達(dá)量，作3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)。條件設(shè)置：95℃預(yù)變性20s，95℃變性15s，60℃退火45s，72℃延伸2min，共40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參GAPDH上游引物：5 ’-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3’，下游引物：5’-CCATGTAGTTGAGGTCAATGAAG-3’[6]。lnc RNA CCHE1上游引物：5’-AAGGTCCCAGGATACTCGC-3’，下游引物：5’-GTGTCGTGGACTGGCAAAAT-3’[7]。基因引物合成由江蘇百奧邁科生物技術(shù)有限公司提供。

1.2.2隨訪：隨訪截止至2019年12月31日，以門診復(fù)查、電話的形式記錄患者預(yù)后情況，包括無(wú)進(jìn)展生存期(progression free survival，PFS)和總生存期(overall survival，OS)，PFS是指受試者入組到腫瘤發(fā)生惡化或死亡的時(shí)間，OS是指受試者入組到死亡的時(shí)間[8]。隨訪頻率：術(shù)后第1年，1次/月；術(shù)后第2年，1次/3個(gè)月；術(shù)后第3年，1次/半年。

2 結(jié) 果

2.1lnc RNA CCHE1在肺腺癌組織及癌旁組織的表達(dá)：肺腺癌組織中l(wèi)nc RNA CCHE1的相對(duì)表達(dá)量為(65.26±5.84)，癌旁組織中為(21.34±1.68)；肺腺癌組織中l(wèi)nc RNA CCHE1的表達(dá)明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2lnc RNA CCHE1表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系：不同性別、年齡的肺腺癌患者lnc RNA CCHE1的表達(dá)情況，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而不同TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度患者lnc RNA CCHE1的表達(dá)情況，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，高TNM分期、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及低分化程度的患者lnc RNA CCHE1表達(dá)量明顯高于低TNM分期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及高分化程度者(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同臨床病理特征患者lnc RNA CCHE1表達(dá)的比較

2.3lnc RNA CCHE1對(duì)肺腺癌的鑒別價(jià)值：lnc RNA CCHE1診斷為肺腺癌的AUC為0.925(95%CI為0.876～0.974)，當(dāng)lnc RNA CCHE1≥29.18時(shí)，敏感度為94.0%，特異度為89.2%，見(jiàn)圖1。

2.4lnc RNA CCHE1表達(dá)與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系：截止2019年12月30日，入組病例死亡22例，存活61例；比較發(fā)現(xiàn)死亡者lnc RNA CCHE1表達(dá)為(73.15±8.45)，明顯高于存活者(59.37±5.19)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.934，P<0.001)。

根據(jù)上述ROC分析結(jié)果，取其臨界值(29.18)將患者區(qū)分為lnc RNA CCHE1高表達(dá)和低表達(dá)，分別有67例和16例。lnc RNA CCHE1高表達(dá)患者術(shù)后3年中位PFS為19.8個(gè)月，3年無(wú)進(jìn)展生存率為32.84%(22/67)，總生存率為68.66%(46/67)。lnc RNA CCHE1低表達(dá)患者術(shù)后3年無(wú)進(jìn)展生存率為81.25%(13/16)，總生存率為93.75%(15/16)。lnc RNA CCHE1高表達(dá)患者術(shù)后3年無(wú)進(jìn)展生存率(Log-rank χ2=11.010，P<0.001)和總生存率(Log-rank χ2=3.899，P=0.048)明顯低于lnc RNA CCHE1低表達(dá)者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

2.5肺腺癌患者術(shù)后生存時(shí)間的影響因素分析：以患者預(yù)后結(jié)局為因變量，對(duì)自變量年齡(<60為1，≥60為2)、TNM分期(Ⅰ期為1，Ⅱ期為2，Ⅲ期為3，Ⅳ期為4)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為0，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為1)、分化程度(高分化為1，中分化為2，低分化為3)及l(fā)nc RNA CCHE1水平(低表達(dá)為1，高表達(dá)為2)進(jìn)行賦值，納入Cox模型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及l(fā)nc RNA CCHE1水平是肺腺癌患者術(shù)后3年P(guān)FS和OS的獨(dú)立影響因素，見(jiàn)表2。

表2 肺腺癌患者術(shù)后預(yù)后的影響因素分析

圖1 lnc RNA CCHE1對(duì)肺腺癌的鑒別價(jià)值

圖2 肺腺癌患者不同lnc RNA CCHE1水平的生存曲線

3 討 論

肺腺癌已成為肺癌最常見(jiàn)的病理類型，占所有肺癌的30%左右，主要起源于支氣管腺體或上皮。臨床表現(xiàn)以干咳、胸痛、氣急等胸部癥狀為主，影像學(xué)檢查可見(jiàn)圓形或橢圓形腫塊[9]。但其早期癥狀缺乏特異性，容易被忽視，而且早期肺腺癌有血行轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。因此，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療對(duì)改善患者預(yù)后有重大的臨床意義，可有效提高患者5年生存率。另外，不同類型的肺癌治療方法不同，準(zhǔn)確判斷腫瘤病理分型也是治療的關(guān)鍵。

隨著分子技術(shù)的發(fā)展，分子靶向治療為失去手術(shù)指征的晚期肺腺癌患者帶來(lái)了新的治療希望。人類全基因組中但僅有不足2%的基因組編碼蛋白，而90%以上的基因轉(zhuǎn)錄本均為非編碼RNAs，參與高級(jí)真核生物表觀遺傳學(xué)的調(diào)控。根據(jù)非編碼RNAs的長(zhǎng)度，將大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNAs定義為lnc RNAs。研究發(fā)現(xiàn)[10]，lnc RNAs可參與腫瘤的生物學(xué)調(diào)控，對(duì)于腫瘤的診斷、治療及預(yù)后極具價(jià)值。lnc RNA CCHE1最初在宮頸癌組織發(fā)現(xiàn)，位于第10 號(hào)染色體基因間區(qū)。據(jù)報(bào)道[11]，lnc RNA CCHE1在宮頸癌組織中異常高表達(dá)，而且與患者腫瘤大小、FIGO分期及預(yù)后密切相關(guān)。隨后，lnc RNA CCHE1被報(bào)道在肝癌、非小細(xì)胞肺癌和胃癌中具有促癌作用[12]。機(jī)制研究方面，lnc RNA CCHE1可通過(guò)PCNA、活化ERK/MAPK等途徑促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖。上述研究表明，lnc RNA CCHE1在體內(nèi)可能具有某種促癌作用，但國(guó)內(nèi)尚無(wú)lnc RNA CCHE1與肺腺癌的相關(guān)報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，肺腺癌組織中l(wèi)nc RNA CCHE1水平明顯高于癌旁組織。進(jìn)一步分析其水平與患者臨床病理特征關(guān)系發(fā)現(xiàn)，高TNM分期、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及低分化程度患者lnc RNA CCHE1表達(dá)更高。上述結(jié)果表明，lnc RNA CCHE1在肺腺癌中可能存在某種調(diào)控機(jī)制，與其發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。ROC曲線分析結(jié)果顯示，lnc RNA CCHE1水平對(duì)于肺腺癌有較高的診斷價(jià)值，提示lnc RNA CCHE1水平可輔助用于臨床肺腺癌的早期診斷，但本研究屬于單一中心、小樣本量研究，后續(xù)還需要開(kāi)展多中心研究，深入研究lnc RNA CCHE1診斷肺腺癌的臨界值。Kaplan-Meier 生存分析結(jié)果表明，Lnc RNA CCHE1高表達(dá)患者術(shù)后3年P(guān)FS生存率和OS生存率明顯低于Lnc RNA CCHE1低表達(dá)者。Cox模型分析結(jié)果顯示，Lnc RNA CCHE1高表達(dá)也是肺腺癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立影響因素。上述結(jié)果表明，Lnc RNA CCHE1可能作為判斷肺腺癌患者預(yù)后的潛在分子標(biāo)志物。

由于肺癌的惡性程度高，病情進(jìn)展迅速，肺癌的早期診斷仍存在較大的困難。臨床數(shù)據(jù)顯示，約有40%的患者確診時(shí)，已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)機(jī)[13]。本研究初步揭示了Lnc RNA CCHE1在肺腺癌中呈高表達(dá)，且與患者臨床病理特征及預(yù)后關(guān)系密切，但其具體的生物學(xué)功能和相應(yīng)的分子機(jī)制還需要深入分析。本研究后期將以Lnc RNA CCHE1為靶點(diǎn)，嘗試探索潛在的治療途徑，為肺腺癌的治療提供新方向。