牛煥付, 牛姝方, 魏澤鋒, 于春娜, 金真真

(濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學中心， 山東 濟寧 272029)

胚胎碎片是評價卵裂期胚胎形態(tài)的重要參數(shù)，高比例碎片可能是導致胚胎凋亡的重要誘因，也會影響胚胎發(fā)育或種植潛能[1]。胚胎碎片產(chǎn)生原因眾多，自噬過程被認為是影響胚胎碎片的主要原因，而Beclin1激活液泡分類蛋白34，促使復合體和自噬體形成則為研究相對較多的基礎(chǔ)機制[2,3]。但是Beclin1不僅參與了自噬的啟動過程，還對胚胎適應壓力、體外發(fā)育、退行性病變等生理病理過程具有一定影響，深入探究Beclin1調(diào)控的自噬過程對胚胎碎片的具體影響，可為清除碎片提高胚胎的發(fā)育潛能提供參考依據(jù)及理論支撐[4]。

1 對象與方法

1.1研究對象：選擇2016年7月至2019年10月我院行取卵體外受精的患者240例，診斷標準：原發(fā)不孕為婚后夫婦同居3年及以上，女方?jīng)]有采取避孕措施而未能受孕。納入標準：35歲以下；不孕病因均為內(nèi)分泌功能失調(diào)；近15d無嚴重的生殖系統(tǒng)炎癥；尚未接受系統(tǒng)治療。排除標準：染色體異?；蛏诚到y(tǒng)發(fā)育畸形；有嚴重器質(zhì)性障礙或原發(fā)性損害；伴發(fā)其他自身免疫性疾病患者[5,6]。兩組患者基本情況構(gòu)成差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，兩組患者均衡性好，可比性高，見表1。

1.2分組方式:拾卵即時復檢，將細胞數(shù)大于6的患者胚胎納入研究范圍，排除受精胚胎(2PN、OPN或1PN)，選取胚胎(3PN)而后根據(jù)碎片含量不同，細分為如下四組：低碎片組(碎片比例<10%)、中低碎片組(25%>碎片比例≥10%)、中高碎片組(50%>碎片比例≥25%)、高碎片組(碎片比例≥50%)[7]。

1.3干擾方式:使用G2囊胚培養(yǎng)液對所選胚胎進行培養(yǎng)，具體方法為：將其放置于35mm培養(yǎng)名中，覆蓋適量礦物油，而后將其置于合適環(huán)境中(37℃、6.5%、CO2)進行培養(yǎng)。使用干擾素(濃度40ng/mL)進行體外刺激和干擾，持續(xù)36h，最后收集細胞用于后期各項指標的定量檢測。

表1 各組患者基本情況

1.4檢測指標:采用免疫印跡法定量檢測相關(guān)蛋白含量，細胞中加入蛋白裂解液RIPA(135μL)進行勻漿裂解，高速離心(11000r/min)后獲取上清液，依次經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、過夜、洗膜、孵育等步驟，加入免疫印跡化學發(fā)光試劑進行檢測。檢測指標具體包括：Beclin1蛋白、PI3K蛋白、LC3B蛋白、mTOR蛋白、AKT蛋白。

2 結(jié) 果

2.1四組患者干擾前后Beclin1相關(guān)蛋白含量比較:干擾前后比較，四組患者Beclin1蛋白、PI3K蛋白含量均顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。干擾前比較Beclin1蛋白或PI3K蛋白含量，從高到低依次為：低碎片組、中低碎片組、中高碎片組、高碎片組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。干擾后比較，四組患者Beclin1蛋白、PI3K蛋白含量的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 患者干擾前后Beclin1及相關(guān)蛋白含量比較

2.2四組患者干擾前后自噬相關(guān)蛋白含量比較:干擾前后比較，四組患者LC3B蛋白、mTOR蛋白、AKT蛋白含量均顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。干擾前比較LC3B蛋白、mTOR蛋白、AKT蛋白含量，從高到低依次為：低碎片組、中低碎片組、中高碎片組、高碎片組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。干擾后比較，四組患者LC3B蛋白含量的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而mTOR蛋白、AKT蛋白含量的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

2.3四組患者干擾后Beclin1與PI3K、LC3B、mTOR、AKT的相關(guān)性:Beclin1與PI3K、LC3B、mTOR、AKT，分別進行相關(guān)性分析，其相關(guān)性均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，具體為：PI3K(r=0.814，P<0.05)、LC3B(r=0.592，P<0.05)、mTOR(r=0.687，P<0.05)、AKT(r=0.716，P<0.05)。

表3 患者干擾前后自噬相關(guān)蛋白含量比較

3 討 論

胚胎碎片產(chǎn)生機制的說法眾多，包括化生學說、誘導學說、遺傳學說、免疫學說等。但是胚胎碎片對胚胎發(fā)育的影響確是公認且統(tǒng)一的，即過多胚胎碎片可導致胚胎胞漿中細胞器減少，致使供能物質(zhì)不足，并降低胚胎之間連接的緊密性，從而增加胚胎染色體非整倍體異常的風險，最終降低胚胎囊胚形成概率[8]。考慮到胚胎碎片對胚胎發(fā)育具有重要且深遠的影響，諸多學者對其進行了深入的基礎(chǔ)研究，旨在通過有效、安全的方法降低或避免胚胎碎片產(chǎn)生。

本研究發(fā)現(xiàn)，干擾后患者Beclin1、PI3K、LC3B、mTOR、AKT蛋白相比干擾前，其含量具有明顯增加，說明人為干擾可產(chǎn)生機械損傷的效果，嚴重刺激胚胎發(fā)育和擴張過程，通過多種通道誘導特征性蛋白的表達，進行性增加胚胎碎片的含量或比例。同時，干擾前6項蛋白含量從高到低依次為：低碎片組、中低碎片組、中高碎片組、高碎片組，4組之間蛋白表達含量差異顯著，說明高比例胚胎碎片能產(chǎn)生和干擾素相同的影響，即誘導特征性通道蛋白高水平表達，甚至促進胚胎凋亡的發(fā)生。

研究還發(fā)現(xiàn)，四組患者干擾后Beclin1、PI3K、LC3B蛋白含量差異顯著，分析原因，干擾素和胚胎碎片可能會產(chǎn)生一定疊加效應，極大促使特征通道蛋白的表達及功能顯現(xiàn)[9]。根據(jù)既有研究，Beclin1蛋白、PI3K蛋白、LC3B蛋白、mTOR蛋白、AKT蛋白聯(lián)系較為密切的通道包括PI3K/Akt/GSK3β、PI3K/mTO、mTOR/β-TrcP/Nrf2等，胚胎碎片具體通過何種路徑或多種路徑影響上述蛋白表達，也有待基礎(chǔ)研究進一步驗證。同時，Beclin1與PI3K、LC3B、mTOR、AKT相關(guān)性均有統(tǒng)計學意義，初步證實Beclin1調(diào)控的自噬過程為啟動因子，對胚胎碎片產(chǎn)生、分布可能均有不利影響。Beclinl作為真核細胞自噬過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，既是自噬啟動的標志物，又是評估自噬嚴重程度、自噬活性的定量標記物[10]。簡單來說，Beclin1可通過調(diào)控相關(guān)蛋白表達來促進多步驟分解代謝途徑，從而啟動Ⅱ型程序性細胞死亡過程?？紤]到胚胎碎片對其發(fā)育過程的具體影響，我們推測Beclin1調(diào)控自噬過程旨在清除不必要的細胞產(chǎn)物，從而將產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)釋放入細胞質(zhì)中，進而為應激狀態(tài)下的胚胎細胞提供能量，并促使能量代謝轉(zhuǎn)化過程[10,11]。具體分析通道蛋白與其他特征蛋白的關(guān)聯(lián)，首先，Beclinl基因下調(diào)或變異可能會介導異位內(nèi)膜細胞自噬行為，促使異位子宮內(nèi)膜細胞黏附于其他細胞外基質(zhì)，導致異位內(nèi)膜快速凋亡[12]。其次，Beclinl的N端Bcl-2同源3結(jié)構(gòu)域參與了LC3B、mTOR鄧家族蛋白的相互作用，失控的Beclinl基因可進行性增加相關(guān)位點癌蛋白濃度，從而激發(fā)細胞自噬過程。