沈仁豪，賈偉，張瑾

（合肥工業(yè)大學(xué)土木與水利工程學(xué)院，安徽合肥 230009）

生物膜與人們的生活息息相關(guān)，在食品加工中，生物膜會(huì)附著于金屬設(shè)備與金屬管道表面，其代謝活動(dòng)很容易讓食品生產(chǎn)過程中出現(xiàn)污染，最終引發(fā)食源性疾病[1]；此外，生物膜可以附著在工業(yè)熱交換系統(tǒng)、通風(fēng)設(shè)備、自來水管道、醫(yī)療器械、病理狀態(tài)下的人體器官表面等。20世紀(jì)70年代，Costerton等[2]首次提出了細(xì)菌生物膜的概念，發(fā)現(xiàn)在許多環(huán)境之中都存在著生物膜形態(tài)的細(xì)菌，比浮游細(xì)菌的數(shù)量更多，物體表面的細(xì)菌更是99.9%都以生物膜的形式存在。生物膜的存在，給食品、醫(yī)療、衛(wèi)生等各個(gè)方面都帶來了巨大損失，然而在污水處理等領(lǐng)域中，生物膜又可以承擔(dān)著處理污廢水和轉(zhuǎn)換能源的重要角色。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種Shewanella. Oneidensis MR-1由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供，菌種號(hào)1A01706。

LB培養(yǎng)基，奧博星；乳酸鈉溶液，分析純，國(guó)藥集團(tuán)；無機(jī)富營(yíng)養(yǎng)液（氯化銨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鉀），分析純，國(guó)藥集團(tuán)；親、疏水碳紙，北京晶龍?zhí)靥伎萍加邢薰?；吖啶橙染色液，南京億訊生物科技有限公司；黑色聚碳酸酯濾膜，上海力敏實(shí)業(yè)有限公司。

Centrifuge5804高速離心機(jī)，美國(guó)Eppendorf；UV2600紫外分光光度計(jì)，上海Unico；TH4-200高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent；IX73+DP倒置顯微鏡，日本Olympus；DNP-9162.1A電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海三發(fā)；I型扁平毛細(xì)玻璃管（0.30 mm×0.03 mm），Electron Microscopy Sciences，USA。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)置

取30個(gè)放入電極的試劑瓶，放入高壓滅菌鍋內(nèi)121 ℃條件下滅菌15 min后，分別配置濃度梯度為 50.000 mmol/L、25.000 mmol/L、12.500 mmol/L、1.250 mmol/L、0.125 mmol/L和0 mmol/L的乳酸鈉溶液（其中已包含無機(jī)富營(yíng)養(yǎng)液），將待加入的無機(jī)富營(yíng)養(yǎng)液放入高壓滅菌鍋內(nèi)121 ℃條件下滅菌15 min后，再各取40 mL加入各個(gè)試劑瓶中。將配置好的希瓦氏菌定量至4.35×108cells/mL數(shù)量級(jí)（OD值≈0.55）10 mL加入各反應(yīng)瓶中，相當(dāng)于濃度梯度為 40mmol/L、20 mmol/L、10 mmol/L、1 mmol/L、0 mmol/L的乳酸鈉溶液。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組平行樣，按照20 min和8 h取樣分析，每次取樣2 mL。實(shí)驗(yàn)在溫度為（30±1）℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)菌數(shù)的測(cè)定

細(xì)菌生物量由紫外分光光度計(jì)以及吖啶橙熒光染色計(jì)數(shù)法確定，其中吖啶橙染色方法為：取適宜濃度的細(xì)菌懸液5 mL，加入0.01%吖啶橙染色液使其占總混合液的5%，混勻后避光靜置染色30 min[3]。為盡量避光以防熒光淬滅，在暗室條件下將經(jīng)過吖啶橙染色的菌液濾過孔徑為0.22 μm的黑色聚碳酸酯濾膜。過濾后取出濾膜，固定在載玻片上，通過熒光顯微鏡在一定倍數(shù)的視野下觀察，隨機(jī)選取至少10個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)細(xì)菌數(shù)量，再通過視野面積和濾膜面積之比算出菌液中細(xì)菌生物量[4]。該菌液統(tǒng)計(jì)出的生物量與菌液在波長(zhǎng)為600 nm的分光光度計(jì)下測(cè)得的吸光度形成對(duì)應(yīng)關(guān)系，分別測(cè)得不同生物量的菌液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)中所得的樣品通過測(cè)得吸光度后參照標(biāo)準(zhǔn)曲線從而得到細(xì)菌的生物量。

1.3.2 運(yùn)動(dòng)速度測(cè)定與統(tǒng)計(jì)方法

在試劑瓶中取2 mL溶液，使用I型扁平毛細(xì)玻璃管提取細(xì)菌液，在顯微鏡下進(jìn)行觀察并錄像，分辨率設(shè)為800×600，感光度設(shè)為ISO 100[5]。

每一組樣品拍攝一段視頻，每個(gè)視頻時(shí)長(zhǎng)2 min，后續(xù)速度分析使用Image J軟件中的Manual tracking插件進(jìn)行細(xì)胞追蹤，使用PotPlayer軟件對(duì)錄像視頻進(jìn)行間隔為0.5 s的截圖以記錄細(xì)菌位置的變化情況，后將截取的序列照片導(dǎo)入Image J中，打開manual tracking插件并作如下設(shè)置：Time interveral設(shè)為0.50 s，x/y calibration為其相對(duì)應(yīng)像素長(zhǎng)度值。點(diǎn)擊Add track按鈕后手動(dòng)追蹤細(xì)胞并進(jìn)行位置標(biāo)識(shí)，直至序列結(jié)束。導(dǎo)出表格中數(shù)據(jù)并在Excel軟件中進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。分別統(tǒng)計(jì)細(xì)菌在實(shí)驗(yàn)開始后20 min和8 h的運(yùn)動(dòng)速度。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取視頻中5個(gè)細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)軌跡平均進(jìn)行分析，每個(gè)細(xì)菌統(tǒng)計(jì)其15 s時(shí)間中運(yùn)動(dòng)30個(gè)點(diǎn)的平均運(yùn)動(dòng)速度。

如公式1所示，采用正態(tài)分布（Gauss Amp公式）對(duì)速度頻率進(jìn)行非線性擬合。

其中，xc為模擬的期望值，y0為曲線底部高度，A為xc對(duì)應(yīng)的曲線高度。

1.3.3 乳酸鈉吸附濃度的計(jì)算

先各取 1 mL濃度為 80 mmol/L、40 mmol/L、20 mmol/L、10 mmol/L和1 mmol/L的乳酸鈉溶液于液相瓶中，用高效液相色譜儀測(cè)得峰面積，與其對(duì)應(yīng)的濃度繪出乳酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)曲線。再將相應(yīng)時(shí)間段得到的不同濃度下實(shí)驗(yàn)樣品各取1 mL，測(cè)定乳酸鈉在溶液中的剩余量，用原有量減去剩余量就可以得到乳酸鈉的減少量。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌附著量

碳紙表面希瓦氏菌附著量如圖1所示，可以看出親水碳紙的希瓦氏菌附著量遠(yuǎn)多于疏水碳紙。在初期附著階段（20 min），親水、疏水碳?xì)旨?xì)菌附著量均在1 mmol/L乳酸鈉濃度下達(dá)到峰值，分別為（9.33±0.92）×107cells/cm2和（1.85±1.33）×107cells/cm2。隨著乳酸鈉濃度的提高，希瓦氏菌附著量呈現(xiàn)先增加后減小的規(guī)律。

培養(yǎng)到8 h時(shí)，疏水碳?xì)譀]有顯著的規(guī)律性，而親水碳?xì)殖尸F(xiàn)出隨著乳酸鈉濃度的提高，附著量增加的規(guī)律。說明貧營(yíng)養(yǎng)濃度在初期附著階段可以促進(jìn)希瓦氏菌的附著，但隨著時(shí)間推移，營(yíng)養(yǎng)濃度的匱乏將滿足不了細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖需求。

2.2 碳紙表面乳酸鈉吸附情況

實(shí)驗(yàn)初始階段，碳紙表面乳酸鈉吸附情況如圖2所示，吸附率為碳紙表面吸附的乳酸鈉濃度所占溶液中整體乳酸鈉濃度的比重。

圖1 碳紙上細(xì)菌附著量

溶液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度對(duì)于親水碳紙吸附乳酸鈉濃度影響顯著（單因素方差分析P＜0.01），親水碳紙上的乳酸鈉溶液吸附率在1 mmol/L乳酸鈉濃度條件下最多，這可能是貧營(yíng)養(yǎng)濃度下可以促進(jìn)希瓦氏菌附著的原因之一。而溶液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度對(duì)于疏水碳紙吸附乳酸鈉濃度的影響并不顯著，且疏水碳紙上的乳酸鈉吸附率極低，這也是疏水碳紙上希瓦氏菌附著量遠(yuǎn)低于親水碳紙的原因。

2.3 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)速度的影響

希瓦氏菌的運(yùn)動(dòng)速度期望值如圖3所示，溶液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度對(duì)于希瓦氏菌運(yùn)動(dòng)速度影響顯著（單因素方差分析P＜0.01）?？梢钥吹皆诔跗诟街A段，細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)速度隨乳酸鈉濃度的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在乳酸鈉濃度為1 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值，為（5.97±0.22）μm/s，這種規(guī)律與初期附著規(guī)律相似，細(xì)菌會(huì)趨向于對(duì)自己生存有利的生存環(huán)境中。

在8 h時(shí)，細(xì)菌運(yùn)動(dòng)速度隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度升高而上升，在40 mmol/L乳酸鈉濃度下達(dá)到運(yùn)動(dòng)速度最大值，為（5.32±0.35）μm/s。說明在初期附著過程結(jié)束后，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏將影響希瓦氏菌的運(yùn)動(dòng)性。

圖3 細(xì)菌運(yùn)動(dòng)速度期望

3 結(jié)論

（1）貧營(yíng)養(yǎng)濃度可以有效促進(jìn)希瓦氏菌的初期附著，從親水、疏水碳紙的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中可以看出，碳紙上營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸附率是導(dǎo)致這一現(xiàn)象出現(xiàn)的關(guān)鍵因素。

（2）貧營(yíng)養(yǎng)濃度可以有效提高希瓦氏菌的初期運(yùn)動(dòng)速度，提高其與碳紙的碰撞概率，這是促進(jìn)初期附著的因素之一。

（3）貧營(yíng)養(yǎng)濃度對(duì)于細(xì)菌附著的促進(jìn)作用隨著時(shí)間的推移會(huì)顯著下降。