郭利軍 鄧會(huì)棟 馮學(xué)杰 羅志文 陳哲 范鴻雁 胡福初 華敏

摘 ?要：采用RT-PCR技術(shù)克隆了1個(gè)編碼NI基因的cDNA序列，命名為MiNI基因，并對(duì)不同來源的中性/堿性轉(zhuǎn)化酶的分子特征及系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明：MiNI基因開放閱讀框?yàn)?034 bp，編碼677個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為76.6 kDa，理論等電點(diǎn)為6.24;生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，NI二級(jí)結(jié)構(gòu)α螺旋占38.85%，無(wú)規(guī)則卷曲占35.45%，伸展鏈占18.91%，β折疊占6.79%;MiNI具有g(shù)lycoside hydrolase family 100結(jié)構(gòu)保守域，與克里曼丁桔、龍眼、巴西橡膠樹和番木瓜都具有一致的motif位點(diǎn);MiNI基因編碼的氨基酸序列與克里曼丁桔、龍眼氨基酸序列同源性最高;構(gòu)建NI系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，與芒果遺傳距離最近的是克里曼丁桔，最遠(yuǎn)的是玉米和枸杞。qRT-PCR分析顯示，果皮MiNI基因表達(dá)量遠(yuǎn)高于果肉;花后10～40 d，果皮MiNI基因表達(dá)量顯著下降;花后40～100 d，果皮MiNI基因表達(dá)量維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定水平;花后100～130 d，隨著果實(shí)成熟，果皮MiNI基因表達(dá)量又顯著上升;而花后10～40 d，果肉MiNI基因表達(dá)量顯著下降，至果實(shí)發(fā)育后期果肉MiNI基因表達(dá)量始終處于極低水平。該研究為進(jìn)一步了解MiNI基因在芒果果實(shí)蔗糖代謝過程中的作用以及從分子角度闡明芒果糖代謝機(jī)理奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：芒果;中性/堿性轉(zhuǎn)化酶;克隆;生物信息學(xué);表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：S667.7;S961.6 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： The cDNA sequence of alkaline/neutral invertase （NI） gene （MiNI） in mango was cloned with Reverse Tran-scription Polymerase Chain Reaction （RT-PCR） in this study. The molecular properties and genetic relationships of NI were compared with different organisms. MiNI contained an open reading frame of 2034 bp， encoding a protein of 677 aa with a theoretical molecular weight 76.6 kDa and an isoelectric point of 6.24. Bioinformatics analysis showed that the secondary structure of NI consisted of alpha helix accounting for 38.85%， random coil accounting for 35.45%， extended strand accounting for 18.91%， and beta turn accounting for 6.79%， of which had the conserved domain of glycoside hydrolase family 100 and the same motif locations as Citrus clementine， Dimocarpus longan， Hevea brasiliensis and Carica papaya. The amino acid sequence encoded by MiNI had the highest homology with that of Citrus clementine， Dimocarpus longan. The analysis of NI phylogenetic tree showed that the closest genetic distance between mango was Citrus clementine， the furthest were Zea mays and Lycium barbarum. qRT-PCR analysis showed that the expression of MiNI in exocarp was much higher than that in mesocarp. MiNI relative expression in exocarp decreased significantly during 10 to 40 days after flowering， while the gene relative expression was maintained at a relatively stable level during 40 to 100 days after flowering. However， MiNI expression increased significantly with fruit ripening during the period from 100 to 130 days after flowering. The gene expression in mesocarp was different from that in exocarp. The gene expression of MiNI in mesocarp decreased significantly during 10 to 40 days after flowering， while the gene relative expression remained at a very low level until the later stage of fruit development. The study would provide a foundation to understand the role of MiNI in sucrose metabolism and further dissection of the sugar metabolism mechanism from molecular perspective.

Keywords： Mangifera indica L.; alkaline/neutral invertase; cloning; bioinformatics; expression analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.09.003

芒果（Mangifera indica L.）是漆樹科常綠大喬木，原產(chǎn)于印度半島至東南亞一帶，素有“熱帶果王”之美譽(yù)，全世界有84個(gè)國(guó)家生產(chǎn)芒果。近十幾年來，海南省芒果種植面積一直穩(wěn)定在4.67萬(wàn)hm2左右，據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2017年全國(guó)熱帶作物生產(chǎn)統(tǒng)計(jì)和海南省統(tǒng)計(jì)年鑒統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，截至2017年底，全國(guó)芒果種植面積25.79萬(wàn)hm2，收獲面積16.31萬(wàn)hm2，全年總產(chǎn)量207.44萬(wàn)t，總產(chǎn)值114.45億元，海南芒果種植面積5.45萬(wàn)hm2，收獲面積4.43萬(wàn)hm2，產(chǎn)量56.73萬(wàn)t，產(chǎn)值28.93億元，分別占全國(guó)的21.12%、27.16%、27.35%和25.28%，海南種植面積、產(chǎn)量和產(chǎn)值分別居全國(guó)第三、第二和第一位。

作為高等植物光合作用的主要產(chǎn)物，蔗糖在果實(shí)發(fā)育過程中發(fā)揮著無(wú)可替代的重要作用。轉(zhuǎn)化酶（invertase， INV）是促使蔗糖進(jìn)入各種代謝途徑的關(guān)鍵酶，其催化蔗糖不可逆水解為葡萄糖和果糖[1]。根據(jù)最適pH，INV可分為酸性轉(zhuǎn)化酶（acid invertase， AI）和中性/堿性轉(zhuǎn)化酶（alkaline/neutral invertase， NI）;根據(jù)亞細(xì)胞定位，可分為細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶（cell wall invertase， CWIN）、細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶（cytoplasmic invertase， CIN）和液泡轉(zhuǎn)化酶（vacuolar invertase， VIN），CWIN和VIN屬酸性轉(zhuǎn)化酶，CIN屬中性轉(zhuǎn)化酶[2]。已有的研究結(jié)果表明，NI是研究蔗糖代謝的關(guān)鍵酶之一[3]，芒果糖代謝研究也不例外。趙家桔[4]的研究結(jié)果表明，‘貴妃芒‘金煌芒‘紅玉芒成熟階段果實(shí)中的果糖含量與AI、NI活性呈顯著相關(guān)，蔗糖含量與蔗糖磷酸合成酶（SPS）和蔗糖合成酶（SS）活性呈顯著相關(guān);但魏長(zhǎng)賓等[5-6]研究‘愛文芒和‘粵西1號(hào)芒后熟階段AI、SS、SPS的活性顯著增加，NI活性略有增加;武紅霞等[7]的研究結(jié)果表明，造成‘臺(tái)農(nóng)1號(hào)芒果實(shí)蔗糖積累的主要原因是成熟階段SPS、SS活性的增加及AI活性的降低，而果實(shí)發(fā)育進(jìn)程中NI活性變化不大。截至目前，已有報(bào)道在龍眼[8]、甘蔗[9]、茶樹[10]、番茄[11]等作物上相繼克隆NI基因并開展相關(guān)研究，雖然芒果上已有上述關(guān)于NI酶活性的報(bào)道，但有關(guān)芒果NI基因的克隆及表達(dá)分析尚未見報(bào)道。

為了明確NI基因在果實(shí)發(fā)育進(jìn)程中的作用，筆者以不同發(fā)育階段的‘臺(tái)農(nóng)1號(hào)果實(shí)為材料，克隆芒果NI基因，命名為MiNI，登錄號(hào)（GenBank No： MN893670），并對(duì)其編碼蛋白和MiNI基因在果實(shí)不同發(fā)育階段的表達(dá)情況進(jìn)行分析，為從分子角度闡明NI基因在果實(shí)發(fā)育進(jìn)程中的作用及明確芒果糖代謝機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

試驗(yàn)材料為種植于海南省樂東縣黃流鎮(zhèn)佛老村10年生‘臺(tái)農(nóng)1號(hào)芒果，芒果出花后至采收，僅進(jìn)行防病蟲藥物噴施，不再進(jìn)行任何處理。選取樹勢(shì)、冠幅、花期相對(duì)一致的植株3株為采樣對(duì)象，分別于花后10、40、70、100、130 d采集不同發(fā)育階段的芒果果實(shí)，隨后立即分離果皮和果肉，快速裝入提前備好的錫箔紙后，馬上放入液氮，返回實(shí)驗(yàn)室后置于?80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 ?方法

1.2.1 ?RNA提取和cDNA合成 ?RNA提取采用北京華越洋科技有限公司的華越洋普通RNA提取試劑盒，具體提取方法參照試劑盒說明書;cDNA第一鏈的合成采用寶生物工程（大連）有限公司的PrimeScript? II Reverse Transcriptase試劑盒，反轉(zhuǎn)錄方法參照試劑盒說明書。

1.2.2 ?MiNI基因全長(zhǎng)cDNA的克隆 ?利用NCBI網(wǎng)站搜索已公布的NI基因片段序列，通過序列比對(duì)找到同源序列，再通過本地Blast從芒果轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)（SRP035450）[12]抓取MiNI基因，使用Snapgene 3.2.1軟件尋找開放閱讀框，利用Primer 5.0在MiNI基因開放閱讀框起始端和終止端設(shè)計(jì)特異引物，MiNIF為5-ATGAATACTGGTAGC TGTATTGGAATC-3，MiNIR為5-TTAAATGA TAATCTTGGTTCTTGAGGC-3，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃ 30 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 2 min，共30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。獲得MiNI基因開放閱讀框序列，連接載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌挑陽(yáng)性菌液測(cè)序，得到MiNI基因編碼區(qū)序列。

1.2.3 ?MiNI基因生物信息學(xué)分析 ?利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Blast程序?qū)iNI基因進(jìn)行同源分析;利用Snapgene 3.2.1軟件尋找開放閱讀框，分析編碼的氨基酸序列組成和分子量;利用ProtParam在線軟件（http：//web.expasy.org/protparam）分析編碼蛋白的等電點(diǎn)等理化性質(zhì);利用NCBI網(wǎng)站Conserved Domains Search功能查找蛋白保守功能結(jié)構(gòu)域;利用Phyre2網(wǎng)站（http：//www.sbg. bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）和PyMOL軟件預(yù)測(cè)MiNI基因編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu);使用MEME（http：//meme-suite.org/）和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）在線軟件進(jìn)行Motif位點(diǎn)分析和功能結(jié)構(gòu)分析，采用Mega 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 ?芒果果實(shí)不同發(fā)育期MiNI基因的表達(dá)分析 ?提取芒果果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期果皮和果肉的RNA，RNA樣本中的DNA利用RNase-free DNase I進(jìn)行消化，消化后1 μg的總RNA用來合成cDNA第一鏈。實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用SYBR Premix Ex Taq熒光染料，在ABI StepOnePlusTM（Ambion， Foster City， CA）儀器上進(jìn)行。利用Primer 5.0于MiNI基因非保守區(qū)設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，MiNI-RTF 5-GAGTATGAGGAATGGCGTAT-3，MiNI-RTR 5-CAAGTATGGTAGCGAGGG-3，以果期穩(wěn)定表達(dá)的MiEF基因?yàn)閮?nèi)參基因[8]。采用2步法進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃，30 s;95 ℃，5 s，60 ℃，34 s，共40個(gè)循環(huán);采用Wang等[9]的方法分析溶解曲線，采用2CT法進(jìn)行相對(duì)定量分析，計(jì)算出MiNI基因在不同階段的相對(duì)表達(dá)量。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?MiNI基因全長(zhǎng)cDNA的克隆

提取芒果果實(shí)總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，反轉(zhuǎn)cDNA;以cDNA為模板，根據(jù)編碼區(qū)起始端、終止端序列設(shè)計(jì)的特異引物進(jìn)行MiNI基因編碼區(qū)PCR擴(kuò)增，凝膠電泳結(jié)果顯示，目的條帶約2000 bp（圖1）。回收目的條帶，連接克隆載體后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致，證實(shí)已成功克隆MiNI基因的cDNA編碼區(qū)。

2.2 ?MiNI基因生物信息學(xué)分析

2.2.1 ?理化性質(zhì)分析 ?克隆的MiNI基因開放閱讀框?yàn)?034 bp，編碼677個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為76.6 kDa，理論等電點(diǎn)為6.24，分子式為C3431 H5373N927O1000S32，不穩(wěn)定系數(shù)（Instability index）為38.67，屬于穩(wěn)定蛋白;親水性為0.222，屬親水性蛋白;Proparam在線軟件分析MiNI基因編碼蛋白的氨基酸組成情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Leu含量較高。

2.2.2 ?蛋白結(jié)構(gòu)分析 ? 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MiNI基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α螺旋（alpha helix， 38.85%）和無(wú)規(guī)則卷曲（random coil， 35.45%）為主，同時(shí)也有少量的伸展鏈（extended strand， 18.91%）和β折疊（beta turn， 6.79%）結(jié)構(gòu);將MiNI基因編碼的氨基酸序列與其他物種NI基因編碼的氨基酸進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均具有g(shù)lycoside hydrolase family 100保守結(jié)構(gòu)域和GDE_C保守結(jié)構(gòu)域，利用NCBI網(wǎng)站Conserved Domains Search功能，查找保守功能結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，MiNI基因編碼的第198～634氨基酸序列為glycoside hydrolase family 100特定匹配序列，第381～435氨基酸序列為GDE_C特定匹配序列（圖2）。

2.2.3 ?同源性分析及進(jìn)化關(guān)系分析 ?通過NCBI blastp程序比對(duì)發(fā)現(xiàn)，MiNI基因編碼氨基酸與柑橘屬的克里曼丁桔（Citrus clementina）NI基因（XP_006419305.1）編碼氨基酸同源性最高，達(dá)84.62%;與龍眼（Dimocarpus longan）NI基因（AJW82915.1）、巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）NI基因（AGQ57013.1）、番木瓜（Carica papaya）NI基因（XP_021906847.1）、菠蘿（Ananas comosus）NI基因（OAY70851.1）、葡萄（Vitis vinifera）NI基因（CBI39621.3）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）NI基因（NP_001319483.1）、玉米（Zea mays）NI基因（AQK52953.1）編碼氨基酸同源性分別為82.48%、79.39%、76.16%、73.88%、70.47%、68.09%、59.48%。

使用MEME（http：//meme-suite.org/）在線軟件Motif Discovery功能，對(duì)與芒果NI同源性較高的克里曼丁桔、龍眼、巴西橡膠樹、番木瓜NI蛋白序列進(jìn)行Motif位點(diǎn)分析，得到10個(gè)保守基序，結(jié)果顯示芒果NI與克里曼丁桔、龍眼、巴西橡膠樹、番木瓜NI具有一致的Motif位點(diǎn)（圖3）;對(duì)10個(gè)保守基序進(jìn)行功能注釋，SWISS-MODEL分析結(jié)果表明，Motif 3-10均為homo-hexamer結(jié)構(gòu)，功能注釋為中性轉(zhuǎn)化酶，Motif 1-2未得到其結(jié)構(gòu)功能信息（表1）。

以MiNI基因編碼氨基酸序列為目標(biāo)序列，在NCBI進(jìn)行Blast比對(duì)，下載各同源序列;利用MEGA 5.0軟件Neighbor-Joining法進(jìn)行氨基酸序列進(jìn)化分析，比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MiNI基因編碼的氨基酸與柑橘屬的克里曼丁桔和龍眼的關(guān)系最近，與玉米和枸杞的關(guān)系最遠(yuǎn)（圖4）。

2.3 ?MiNI基因相對(duì)表達(dá)分析

以花后10 d MiNI基因表達(dá)量為對(duì)照（由于此時(shí)新生芒果直徑不足2 mm，無(wú)法將果皮果肉分開，所以圖5中10 d的基因表達(dá)量?jī)H用一橫線柱表示），芒果果實(shí)不同發(fā)育階段MiNI基因的表達(dá)結(jié)果顯示，在果實(shí)的不同發(fā)育時(shí)期，MiNI基因的相對(duì)表達(dá)量存在顯著性差異。從花后10～40 d，MiNI基因表達(dá)量顯著下降，果皮和果肉Ct值達(dá)到0.4345和0.0289;花后40～100 d，果皮中基因表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定，無(wú)顯著差異，Ct值維持在0.4275～0.5001之間，而果肉表達(dá)量維持在一個(gè)更低的水平;直至130 d果實(shí)成熟度最高時(shí)，果皮表達(dá)量又顯著增高至0.7979，但此時(shí)果肉中MiNI基因表達(dá)量降低至最低水平，Ct值僅為0.0007。從圖5可看出，MiNI基因表達(dá)主要在果皮中，果肉中表達(dá)量很低，且果實(shí)發(fā)育各時(shí)期果皮內(nèi)MiNI基因表達(dá)量均顯著高于果肉。

不同小寫字母表示不同處理間差異顯著（P<0.05）。

3 ?討論

本研究基于芒果轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)（SRP-035450）[12]，克隆了與NI基因高度同源的cDNA序列，測(cè)序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)序列一致，表明成功克隆了MiNI基因序列。蛋白結(jié)構(gòu)保守域分析表明，芒果NI具有g(shù)lycoside hydrolase family 100結(jié)構(gòu)保守域，glycoside hydrolase family 100是糖苷水解酶的一個(gè)家族，糖苷水解酶主要功能為水解碳水化合物的糖苷鍵，AI和NI均屬于糖苷水解酶家族100成員[13-14]。同時(shí)，本研究通過MEME在線網(wǎng)站分析預(yù)測(cè)了NI 10個(gè)Motif位點(diǎn)，結(jié)果表明芒果、克里曼丁桔、龍眼、巴西橡膠樹和番木瓜具有一致的Motif位點(diǎn)，根據(jù)結(jié)構(gòu)相似功能相似的原理，也可證實(shí)成功克隆了MiNI基因。本研究對(duì)MiNI基因進(jìn)行了包括同源性分析、保守結(jié)構(gòu)域分析、Motif位點(diǎn)分析和進(jìn)化分析在內(nèi)的較為全面的生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明，MiNI基因與其它植物NI基因相似性很高，進(jìn)化較為保守。

qRT-PCR分析結(jié)果顯示，從花后40 d至果實(shí)發(fā)育后期，果皮MiNI基因表達(dá)量始終高于果肉，這與王婷婷等[15]的研究結(jié)果一致，而關(guān)于果皮和果肉中NI酶活性和蔗糖、果糖、葡萄糖含量的測(cè)定也將是今后研究的內(nèi)容，研究結(jié)果將有利于闡明果皮果肉在糖代謝過程中的地位和作用;另一方面，武紅霞等[7]關(guān)于‘臺(tái)農(nóng)1號(hào)芒果的研究結(jié)果表明，整個(gè)果實(shí)發(fā)育期間，果肉NI酶活性變化不大，處于相對(duì)穩(wěn)定水平，這與本研究中果肉MiNI基因表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定，始終處于較低水平的結(jié)果也是相符的。Gao等[16]研究表明，NI基因的表達(dá)量與NI活性呈顯著正相關(guān)，Joubert等[17]通過轉(zhuǎn)化反義NI基因至甘蔗，懸浮培養(yǎng)14 d，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中NI活性顯著降低，使得蔗糖濃度顯著增加，己糖含量明顯降低，這表明NI基因在糖代謝途徑發(fā)揮了重要作用。另一方面，桃果實(shí)研究結(jié)果暗示NI基因可能在糖代謝中發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用[18]。綜上所述，NI基因在植物發(fā)育過程中起重要作用，為分析該基因在芒果蔗糖代謝途徑中的作用和利用分子生物學(xué)手段調(diào)控NI基因的表達(dá)，進(jìn)而改變果實(shí)糖含量和改良果實(shí)品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 潘秋紅， 張大鵬. 植物轉(zhuǎn)化酶的種類﹑特性與功能[J]. 植物生理學(xué)通訊， 2004（3）： 275-280.

[2] Masuda H， Takahashi T， Sugawara S. The occurrence and properties of alkaline invertase in mature roots of sugar beets[J]. Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan， 2006， 51（9）： 2309-2314.

[3] Yao Y， Geng M T， Wu X H， et al. Genome-wide identification， expression， and activity analysis of alkaline/neutral invertase gene family from cassava （Manihot esculenta Crantz）[J]. Plant Molecular Biology Reporter， 2015， 33（2）： 304-315.

[4] 趙家桔. 芒果品質(zhì)構(gòu)成及其發(fā)育規(guī)律的研究[D]. ?？冢?海南大學(xué)， 2010.

[5] 魏長(zhǎng)賓， 武紅霞， 馬蔚紅， 等. 芒果成熟階段蔗糖代謝及其相關(guān)酶類研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2008， 21（4）： 972-974.

[6] 魏長(zhǎng)賓， 武紅霞， 馬蔚紅， 等. 粵西 1 號(hào)芒果成熟階段的蔗糖代謝[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2009， 30（6）： 735-739.

[7] 武紅霞， 邢姍姍， 王松標(biāo)， 等. ‘臺(tái)農(nóng)1號(hào)芒果果實(shí)發(fā)育過程中的糖分積累與相關(guān)酶活性研究[J]. 西北植物學(xué)報(bào)， 2011， 31（9）： 1811-1815.

[8] 帥 ?良， 廖玲燕， 韓冬梅， 等. 龍眼中性轉(zhuǎn)化酶基因（DlNI）的克隆及分析[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2017， 30（10）： 2202-2209.

[9] Wang L M， Zheng Y X， Ding S H， et al. Molecular cloning， structure， phylogeny and expression analysis of the invertase gene family in sugarcane[J]. BMC Plant Biology， 2017， 17（1）： 109.

[10] 錢文俊， 岳 ?川， 曹紅利， 等. 茶樹中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因CsINV10的克隆與表達(dá)分析[J]. 作物學(xué)報(bào)， 2016， 42（3）： 376-388.

[11] 高媛媛， 楊郁文， 張保龍， 等. 番茄中性/堿性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因的電子克隆、分析及表達(dá)載體的構(gòu)建[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2009， 37（6）： 36-38.

[12] 武紅霞， 許文天， 羅 ?純， 等. 芒果果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝及基因功能注釋[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2016， 37（11）： 2191-2198.

[13] Lee H， Sturm A. Purification and characterization of neutral and alkaline invertase from carrot[J]. Plant Physiology， 1996， 112（4）： 1513-1522.

[14] Sturm A. Invertases. primary structures， functions， and roles in plant development and sucrose partitioning[J]. Plant Physiology， 1999， 121（1）： 1-8.

[15] 王婷婷， 趙紫涵， 張雅彬， 等. 枸杞中性轉(zhuǎn)化酶NI基因的克隆及組織表達(dá)分析[J/OL]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)， ?（2019-04-24）[2019-12-01]. https：//navi.cnki.net/knavi/Journ-alDetail？pcode=CJFD&pykm=GXNB.

[16] Gao F， Cao X F， Si J P， et al. Characterization of the alkaline/neutral invertase gene in Dendrobium officinale and its relationship with polysaccharide accumulation[J]. Genetics and Molecular Research， 2016， 15（2）： 1-8.

[17] Joubert D， Bosch S， Botha F C， et al. Down-regulation of neutral invertase activity in sugarcane cell suspension cultures leads to increased sucrose accumulation[J]. South African Journal of Botany， 2007， 73（2）： 293.

[18] Nonis A， Ruperti B， Falchi R， et al. Differential expression and regulation of a neutral invertase encoding gene from peach （Prunus persica）： evidence for a role in fruit development[J]. Physiologia Plantarum， 2007， 129（2）： 436-446.