張梅 張杰 王強

摘 要：研究不同溫度以及不同濃度赤霉素對南川百合種子萌發(fā)的影響，并以南川百合的鱗片和葉片作為外植體探究南川百合組培快繁技術，探究無機鹽濃度對南川百合外植體分化的影響。結果表明：處理條件為16℃加200mg·L-1赤霉素時南川百合種子萌發(fā)率最高，萌發(fā)速度也最快，溫度對南川百合種子萌發(fā)率的影響具有顯著性;當用南川百合的鱗片作為外植體時，MS加2.0mg·L-16-BA加0.1mg·L-1NAA為最佳誘導分化培養(yǎng)基，無機鹽和有機物濃度高鱗片外植體分化率也較高;當用南川百合葉片作為外植體時，MS加1.0mg·L-16-BA加0.1mg·L-1NAA為最佳誘導分化培養(yǎng)基，無機鹽和有機物濃度越高外植體分化率越低。

關鍵詞：南川百合;種子萌發(fā);組織培養(yǎng);外植體

中圖分類號：S-3 ? ? ? 文獻標識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200930047

南川百合（Lilium rosthornii Diels）為百合科百合屬多年生草本植物，是我國特有的原生百合之一，具有較高的園藝觀賞價值和一定藥用價值。由于南川百合對生長環(huán)境的要求比較苛刻，加之人為采挖比較嚴重，目前野生南川百合種質資源急劇減少甚至在一些分布區(qū)已經絕跡[1]，因此對于南川百合的生長繁育進行研究十分有必要。

目前，國內關于南川百合種子萌發(fā)特性的報道較少[2，3]，關于南川百合組織培養(yǎng)的研究通常以鱗片為外植體，聚焦于研究激素配比和有機添加物對誘導分化的影響[4-8]。本文通過試驗探究溫度和赤霉素對南川百合種子萌發(fā)的影響，以鱗片和葉片為外植體研究南川百合組培快繁條件，特別研究了無機鹽和有機物濃度對南川百合外植體分化的影響，對促進南川百合人工繁育技術有一定參考意義。

1 試驗與方法

1.1 試驗材料

南川百合引種自湖北宜昌，栽培于阿壩師范學院花卉繁育基地;種子為頭年采收種子，選取飽滿、大小相近的種子進行實驗;鱗片選取飽滿無病蟲害的鱗片，葉片選取植株較上端的幼嫩無病害葉片。實驗中所用無機鹽和蔗糖均為AR級，其它有機物和植物生長調節(jié)劑為BR級。

1.2 試驗方法

1.2.1 溫度和GA3對南川百合種子萌發(fā)的影響

選取顆粒飽滿大小均勻的種子，裝入尼龍網(wǎng)袋，用流水沖洗20min，將種子分為5組，分別放置于0mg·L-1、50mg·L-1、100mg·L-1、150mg·L-1及200mg·L-1的GA3溶液中浸泡6h。浸泡完成后，將種子平鋪于無菌蒸餾水潤濕的滅菌濾紙上，放到玻璃培養(yǎng)皿中，置于人工氣候箱中培養(yǎng)。4臺人工氣候箱的溫度分別設為16℃、19℃、22℃和25℃，濕度為75%，光照強度為2600Lx，光照時長為12h·d-1;每個氣候箱都包含5種GA3處理條件的種子，每個條件以20粒種子為1組。每3d觀察1次，胚根露出種皮后，每天觀察1次，做好數(shù)據(jù)記錄。

1.2.2 鱗片外植體的初代培養(yǎng)

取鱗莖中外層飽滿健康鱗片，沖洗凈泥土，用含少量洗衣粉溶液浸泡10min，用自來水沖洗20min備用;外植體消毒條件為75%乙醇浸泡30s后，再放入0.1%的升汞溶液浸泡8min，接著用無菌水沖洗5～6次;將消毒后的鱗片切成邊長0.5～1cm的方塊接種到初代培養(yǎng)基上，初代培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，蔗糖濃度為40g·L-1，瓊脂為8g·L-1，pH為5.6～6.0，以NAA和6-BA為誘導分化激素，設計試驗見表1。接種完成后置于培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光照強度1500～2000Lx，光照時間12h·d-1，溫度為25±2℃。

1.2.3 無機鹽和有機物濃度對鱗片外植體分化的影響

為探究無機鹽和有機物濃度對鱗片外植體分化的影響，分別以MS，1/2MS，1/4MS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，蔗糖濃度為40g·L-1，瓊脂為8g·L-1，以鱗片外植體初代培養(yǎng)實驗所確定的具有最佳誘導分化效果的激素配比作為激素處理條件，外植體消毒及接種后的培養(yǎng)條件同上。

1.2.4 葉片外植體的初代培養(yǎng)

取南川百合植株上部幼嫩無病害葉片，在流水下沖洗20min，然后于超凈工作臺用75%乙醇浸泡8s，無菌水沖洗3次，再用0.1%升汞溶液浸泡5min，最后用無菌水清洗5～6次，每次2～3min，將消毒好的葉片放在無菌濾紙上吸干表面的水分，用手術刀切割為大約1cm×1cm的小塊接種到培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基蔗糖濃度為40g·L-1，瓊脂為8g·L-1，激素添加情況如表2所示。每個處理條件接種30塊外植體，培養(yǎng)條件同鱗片外植體初代培養(yǎng)。

1.2.5 無機鹽和有機物濃度對葉片外植體分化的影響

以MS、1/2MS、1/4MS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，蔗糖濃度為40g·L-1，瓊脂為8g·L-1，以葉片外植體初代培養(yǎng)實驗所確定的具有最佳誘導分化效果的激素配比作為激素處理條件，外植體消毒及接種后的培養(yǎng)條件同葉片外植體的初代培養(yǎng)。

1.2.6 生根培養(yǎng)

生根培養(yǎng)采用趙靜確定的培養(yǎng)條件1/2MS加10.0mg·L-1PP333加0.5mg·L-1NAA[5]。

1.2.7 組培苗的移栽煉化

待組培苗長至3～4cm高時，將培養(yǎng)瓶置于室內無陽光直射處煉苗7d，然后擰松瓶蓋培養(yǎng)2d，再完全揭去瓶蓋于室內靜置3d，使組培苗逐漸適應外界環(huán)境，最后將組培苗從培養(yǎng)瓶移出，小心洗凈根部瓊脂，種植于培養(yǎng)基質中，培養(yǎng)基質配比為田園土∶珍珠巖∶蛭石=2∶1∶1。

2 結果與分析

2.1 溫度及GA3對南川百合種子萌發(fā)的影響

按照前述方法，將GA3處理好的種子置于不同溫度人工氣候箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)35d后統(tǒng)計數(shù)據(jù)如表3所示。從表3可知，南川百合種子萌發(fā)率最高的處理組合為200mg·L-1GA3浸泡6h加16℃恒溫培養(yǎng)，在該條件下種子萌發(fā)率為70%，開始萌發(fā)時間最短，僅為13d。用SPSS25對實驗結果做方差分析和多重比較，結果表明，在顯著性水平為0.05情況下，GA3處理對南川百合種子萌發(fā)沒有顯著影響，溫度對南川百合種子萌發(fā)的影響具有顯著性，溫度的F值為7.378，最適南川百合種子萌發(fā)的溫度為16℃。

2.2 鱗片外植體的初代培養(yǎng)

南川百合鱗片外植體初代培養(yǎng)30d后統(tǒng)計數(shù)據(jù)見表4。從表4可知，在MS加2.0mg·L-16-BA加0.1mg·L-1NAA的培養(yǎng)條件下鱗片外植體有最高的分化率為46.67%。

2.3無機鹽和有機物濃度對鱗片外植體分化的影響

以MS、1/2MS、1/4MS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基另外添加2.0mg·L-16-BA加0.1mg·L-1NAA，誘導南川百合鱗片外植體分化產生不定芽，培養(yǎng)30d后結果如表5所示。從表5可知，MS加2.0mg·L-16-BA加0.1mg·L-1NAA的培養(yǎng)培養(yǎng)條件有最高的分化出芽率，1/4MS加2.0mg·L-16-BA加0.1mg·L-1NAA分化出芽率最低;并且MS培養(yǎng)基上生長的不定芽株形正常、長勢更佳、葉片更綠，而1/2MS和1/4MS培養(yǎng)基上生長的不定芽生長更慢，葉片易發(fā)黃枯萎（如圖1所示）。由此可見，較高的無機鹽和有機物濃度有利于南川百合鱗片外植體分化產生不定芽，也有利于不定芽生長發(fā)育。

2.4 葉片外植體的初代培養(yǎng)

按前述試驗設計接種南川百合葉片外植體，培養(yǎng)30d后觀察統(tǒng)計的試驗結果見表6。從表6可知，在MS加1.0mg·L-16-BA加0.1mg·L-1NAA的培養(yǎng)條件下，南川百合的葉片外植體有最高的愈傷組織分化率，分化率達60%;當培養(yǎng)基6-BA濃度達2.0mg·L-1時，對南川百合葉片外植體的分化有明顯的抑制作用;在不添加外源激素的培養(yǎng)條件下，葉片外植體也基本不分化。將試驗數(shù)據(jù)用SPSS25進行方差分析和多重比較，結果表明，在顯著性水平為0.05情況下，6-BA對南川百合葉片外植體的分化具有顯著影響，F(xiàn)值為11.139，6-BA濃度為1.0mg·L-1時最有利于葉片外植體的分化，與其它培養(yǎng)條件相比具有顯著差異。

2.5 無機鹽和有機物濃度對葉片外植體分化的影響

以MS、1/2MS、1/4MS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基另外添加1.0mg·L-16-BA加0.1mg·L-1NAA，誘導南川百合葉片外植體分化產生不定芽，培養(yǎng)30d后結果如表7所示。從表7可知，1/4MS加1.0mg·L-16-BA加0.1mg·L-1NAA的培養(yǎng)條件最有利于南川百合葉片外植體分化不定芽，其不定芽分化率為26.67%，而MS加1.0mg·L-16-BA加0.1mg·L-1NAA的培養(yǎng)條件下葉片分化率最低，表現(xiàn)出低濃度的無機鹽和有機物水平有利于南川百合葉片外植體的分化，這與鱗片外植體的情況剛好相反。從圖2可知，培養(yǎng)30d后在MS培養(yǎng)基上多數(shù)葉片外植體已經壞死，有少量外植體分化出小小的芽點。而此時，在1/2MS和1/4MS培養(yǎng)基上的不定芽已經生長到2～4cm高，部分在1/4MS培養(yǎng)基上生長的不定芽已經分化出根。

2.6 組培苗的煉化栽培

以前述方法進行組培苗的煉化移栽，30d后統(tǒng)計成活率，成活率達91.4%。

3 分析與展望

試驗表明，較低的溫度有利于南川百合種子的萌發(fā)，而GA3的處理對南川百合種子的萌發(fā)則沒有表現(xiàn)出明顯的促進作用，南川百合種子萌發(fā)不需要黑暗的條件，但黑暗環(huán)境和光照環(huán)境誰更有利于南川百合種子萌發(fā)還有待進一步研究?？傮w來看，南川百合種子萌發(fā)不存在困難，播種繁殖是南川百合一條有效繁殖途徑。

和多數(shù)野生百合一樣，南川百合的鱗片外植體也是比較容易分化的，但有試驗表明，南川百合的葉片外植體分化比較困難[5]。通過試驗發(fā)現(xiàn)，MS加1.0mg·L-16-BA加0.1mg·L-1NAA的培養(yǎng)條件比較有利于南川百合葉片外植體的分化，特別是1.0mg·L-16-BA對南川百合葉片外植體分化有明顯的促進作用，但在MS培養(yǎng)基上葉片外植體分化出的多數(shù)為愈傷組織，要經過較長時間生長才有少量愈傷組織開始分化不定芽。同時也發(fā)現(xiàn)較高濃度的6-BA會明顯抑制南川百合葉片外植體的分化，在2.0mg·L-16-BA的培養(yǎng)條件下沒有發(fā)現(xiàn)一份葉片外植體分化，培養(yǎng)一段時間都枯萎死亡，所以在誘導南川百合葉片外植體分化的實驗中，6-BA的濃度是一個關鍵的因素，但相關機理還有待進一步探索。

在研究無機鹽和有機物濃度對南川百合外植體分化的影響時，發(fā)現(xiàn)較高濃度的無機鹽和有機物（如MS培養(yǎng)基）有利于南川百合鱗片外植體分化產生不定芽，而較低濃度的無機鹽和有機物（如1/4MS培養(yǎng)基）有利于南川百合葉片外植體分化產生不定芽。在已有的報道中，百合葉片外植體的分化往往是比較困難的，但是卻很少試驗1/2MS和1/4MS培養(yǎng)基對葉片分化不定芽的影響，1/2MS和1/4MS培養(yǎng)基通常用于和生根培養(yǎng)有關的試驗中。從本文試驗來看，較低濃度的無機鹽和有機物有利于南川百合葉片分化不定芽，對于其它種類的野生百合是否也存在這樣的現(xiàn)象是非常值得進行研究的。

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（責任編輯 ?周康）