李瑞敏，丁艷艷，張永祥

(首都醫(yī)科大學(xué)大興教學(xué)醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，北京 大興 102600)

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一種致死率極高的慢性肺循環(huán)疾病，病理生理機(jī)制為肺循環(huán)阻力的增加，引起右心室后負(fù)荷增加，導(dǎo)致右心室重構(gòu)，嚴(yán)重時(shí)誘發(fā)右心衰竭，甚至造成死亡[1]。因此尋求療效確切且能有效改善肺血管及右心室重構(gòu)的藥物具有重要意義[2]。

研究表明[3]，野百合堿(monocrotaline,MCT)可以誘導(dǎo)PAH大鼠右室心肌氧含量降低、心肌細(xì)胞線粒體氧耗上調(diào)。依帕司他(epalrestat，EPS)是典型的醛糖還原酶選擇性抑制劑，研究發(fā)現(xiàn)EPS具有降壓、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和血管重構(gòu)等作用[4-5]，本文擬研究EPS對MCT誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠右心室重構(gòu)的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取SD大鼠80只，體質(zhì)量180～200 g，10周齡，購自蘇州工業(yè)園區(qū)愛爾麥特科技有限公司，許可證號：SDK(蘇)2009-0001；所有大鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)鼠籠，每籠5只，室溫22～25 ℃，濕度35%～50%，自由攝食及飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行試驗(yàn)，隨機(jī)分為對照組、模型組、50 mg/kg EPS，100 mg/kg EPS組，每組20只。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肺動脈高壓大鼠模型建立 按照經(jīng)典方法給予SD大鼠60mg/kg皮下注射野百合堿構(gòu)建PAH大鼠模型，對照組皮下注射等量的生理鹽水。造模過程中的28天內(nèi)，模型組共自發(fā)性死亡大鼠7只，死亡率為35%。

1.2.2 藥物干預(yù) 首先用蒸餾水將磨成粉末狀的EPS稀釋成混懸液，自注射MCT之日起，分別給予50 mg/kg EPS，100 mg/kg EPS，模型組給予等量的生理鹽水。一直持續(xù)28天，并全程密切觀察大鼠的一般情況和生存狀態(tài)并記錄。

1.2.3 血流動力學(xué)指標(biāo)測定 首先用60 mg/kg的戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉大鼠，將直徑為0.5 mm的聚乙烯PE導(dǎo)管連接上壓力換能器并經(jīng)右頸外靜脈插入右心室及肺動脈，MedLab-TA6008多導(dǎo)生理記錄儀(南京美易科技有限公司生產(chǎn))分別記錄右心室收縮壓(RVSP)、平均肺動脈壓(mPAP)和肺動脈收縮壓(PASP)[6]。

1.2.4 組織標(biāo)本處理及測定

上一步結(jié)束后，打開胸腔暴露心和肺，在右心室剪一小口，并剪開左房，將連于灌注裝置的磨平的針頭經(jīng)右心室插入至肺動脈，開啟灌注裝置，用生理鹽水沖洗肺至干凈，取出心臟，去掉大血管和心房，分離左、右心室，濾紙吸干表面水分，稱RV重及LV+SEP重，并計(jì)算右心室肥厚指數(shù)(RVHI)，右心室質(zhì)量指數(shù)(RVMI)[7]。將右心室心尖處組織置于4%多聚甲醛固定2天，用于制備石蠟切片;準(zhǔn)確稱取100 mg右心室組織置于液氮中研磨并加入1 mL Trizol試劑進(jìn)行裂解，置于-80℃冰箱保存；剩余右心室置于液氮中研磨，并在冰上用裂解液對組織裂解30 min，于4 ℃ 12 000 r/min離心10 min后提取蛋白，檢測相關(guān)蛋白表達(dá)水平。

1.2.5 HE觀察

用4%多聚甲醛固定大鼠右心室心尖部48 h，石蠟包埋切片，進(jìn)行HE染色，具體操作步驟如下：將石蠟切片置于烘箱中60 ℃烤1～2 h；石蠟切片常規(guī)二甲苯，乙醇脫蠟至水，蘇木素染10 min，流水沖洗，去余色，7%鹽酸乙醇分化數(shù)秒鐘，流水沖洗，切片變藍(lán)約15 min，95%乙醇30 s，酒精性伊紅染30 s，95%乙醇30 s兩次，100%乙醇30 s兩次，石碳酸二甲苯30 s，二甲苯30 s兩次，中性樹膠封片[8]。

1.2.6 免疫組化染色

免疫組化染色采用鏈霉素蛋白-生物素免疫染色法。首先常規(guī)石蠟切片脫蠟水化，PBS洗滌3 min，滴加0.3%H2O2，并于37 ℃孵育20 min，再用PBS洗滌3 min后用正常血清封閉20 min，接著一抗孵育過夜(4 ℃)，用PBS洗滌3 min，用二抗室溫37 ℃孵育0.5 h，用PBS洗滌，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，并室溫孵育0.5 h，PBS洗滌3 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明。中性樹膠封片。染色過程中用PBS緩沖液取代一抗作為空白對照[9]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.2 大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)

與對照組相比，RVSP、mPAP和PASP在模型組顯著增高，給予EPS后RVSP、mPAP和PASP顯著降低，并呈劑量依賴效應(yīng)。見表1。

表1 各組大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)比較

2.3 大鼠右心室重構(gòu)指標(biāo)

與對照組比較，模型組RVHI和RVMI顯著增加，給予EPS干預(yù)后，RVHI和RVMI顯著降低，并呈劑量依賴效應(yīng)。見表2。

2.4 大鼠右心室心肌HE染色

對照組右心室心肌纖維排列整齊，胞漿染色均勻，胞核位于中央，呈卵圓形，核膜邊界清楚；模型組心肌纖維排列紊亂，橫紋消失，心肌細(xì)胞肥大，部分胞核寬大畸形；EPS組心肌形態(tài)學(xué)改變較模型組有所改善，其中高劑量組好于低劑量組。見圖1。

表2 各組大鼠右心室重構(gòu)指標(biāo)比較

圖1 右心室心肌HE染色觀察(200×)A：對照組；B：模型組；C：50 mg/kg EPS組；D：100 mg/kg組

2.5 各組右心室心肌Cx43表達(dá)

與對照組比較，模型組Cx43光密度顯著降低，給予EPS干預(yù)后，Cx43光密度顯著增高，并呈劑量依賴效應(yīng)。說明PAH大鼠右心室心肌Cx43表達(dá)降低，EPS逆轉(zhuǎn)右心室重構(gòu)與增加Cx43表達(dá)有關(guān)。見表3和圖2。

表3 各組大鼠右心室心肌Cx43比較

圖2 Cx43免疫組化染色(200×)A：對照組；B：模型組；C：50 mg/kg EPS組；D：100 mg/kg組

3 討 論

MCT是從野百合中提取的一種雙稠吡咯類生物堿，本身是無活性的，在大鼠肝臟內(nèi)經(jīng)P450氧化酶可轉(zhuǎn)化為有活性的脫氫產(chǎn)物野百合堿吡咯，可以選擇性作用于肺血管床[10]。MCT可選擇性地?fù)p傷肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起肺小動脈平滑肌細(xì)胞進(jìn)行性增殖、肺動脈血管內(nèi)栓塞形成、誘導(dǎo)肺小動脈肌化和重構(gòu)、降低內(nèi)膜完整的肺血管數(shù)量、升高肺阻力，最終導(dǎo)致肺動脈高壓[11]。皮下注射MCT是公認(rèn)的用于研究肺動脈高壓、非原發(fā)于心臟的右心室重構(gòu)和右心衰竭的方法[12]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明，采用MCT能成功構(gòu)建肺動脈高壓和右心室重構(gòu)的動物模型。醛糖還原酶(AR)是多元醇通路的關(guān)鍵酶，具有NADPH依賴性。AR被激活后可以使NADPH/NADP+比值下降，從而降低抗氧化能力，進(jìn)而增強(qiáng)氧化應(yīng)激反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，AR/NADPH氧化酶-4(NOX-4)介導(dǎo)的氧化應(yīng)激在肺動脈高壓右心室重構(gòu)中發(fā)揮了重要的作用[13]。EPS為AR抑制劑，可通過抑制AR表達(dá)，抑制NOX-4介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而改善肺動脈高壓大鼠右心室重構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)造模的28天內(nèi)，模型組共自發(fā)性死亡大鼠7只，死亡率為35%，對照組、EPS組無大鼠死亡，說明EPS可以降低MCT誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠的死亡率，也間接地說明EPS可以減輕肺動脈高壓對大鼠的病死率。從血流動力學(xué)指標(biāo)(RVSP、mPAP和PASP)可以看出，由高到低的是模型組、EPS組、對照組，說明示EPS具有降低PAH大鼠肺動脈壓力的作用。從右心室重構(gòu)指標(biāo)可以看出，與對照組相比，模型組RVHI和RVMI明顯升高，說明MCT成功制造肺動脈高壓模型和右心室重構(gòu)模型，給予EPS干預(yù)后，PAH大鼠右心室重構(gòu)得到抑制。通過對大鼠的右心室心肌進(jìn)行HE染色，結(jié)果說明肺動脈高壓大鼠的右心室心肌紊亂，EPS在抑制肺動脈高壓同時(shí)，也能改善心肌結(jié)構(gòu)。Cx43是哺乳類動物心室工作細(xì)胞最重要的縫隙連接蛋白，它的正常表達(dá)和分布是心肌細(xì)胞正?；顒蛹皡f(xié)調(diào)舒縮的重要保證[14]。當(dāng)壓力負(fù)荷持續(xù)存在時(shí)(例如肺動脈高壓)，Cx43的密度會比正常減少40%，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組Cx43的表達(dá)顯著降低、注射EPS后Cx43的表達(dá)顯著增加。結(jié)合前面結(jié)果，我們推測EPS可能是通過上調(diào)了Cx43表達(dá)量逆轉(zhuǎn)肺動脈高壓大鼠右心室重構(gòu)[15]。

綜上所述，EPS可以減輕MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠右心室重構(gòu)，其機(jī)制可能與增加右心室心肌Cx43表達(dá)，抑制醛糖還原酶作用有關(guān)。