鮑 亮,趙 晨,劉 琮,朱 鵬,周 濤,張 兵

(西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院骨外科，陜西 西安 710038)

隨著人口老齡化進程的加劇，骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)的發(fā)病率也逐漸上升，且隨著年齡的增加而不斷增高,OA是指患者關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)的退行性改變。其中，膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)最為多見,其病理特征是膝關(guān)節(jié)軟骨的不斷退變，軟骨下骨的病變，骨贅形成的退行性骨關(guān)節(jié)病變[1]。臨床診斷主要是依靠患者的癥狀、體征以及影像學(xué)檢查來判斷。多數(shù)患者因疼痛、活動受限來院檢查時發(fā)現(xiàn)已經(jīng)為中晚期，膝關(guān)節(jié)功能受到嚴重的影響，有些到了疾病的晚期，甚至致殘[2]。我們認為這主要是因為臨床檢查在時間上滯后于膝關(guān)節(jié)炎病變的發(fā)展。所以，早診斷、早治療對于KOA的預(yù)防和治療意義尤為重要。近年來，隨著對OA發(fā)病機制的深入研究，發(fā)現(xiàn)對關(guān)節(jié)液、血液等體液中一些生化指標(biāo)的檢測可以反應(yīng)關(guān)節(jié)腔內(nèi)微環(huán)境的變化，這些指標(biāo)可以反映出OA的發(fā)生發(fā)展，并對判斷疾病的進程具有指導(dǎo)意義。經(jīng)過前期指標(biāo)篩選后，本研究擬選擇KOA患者關(guān)節(jié)液和血清中的白細胞介素-1(IL-1)以及腫瘤壞死因子(TNF-α)這兩種炎癥因子，作為評估骨性關(guān)節(jié)炎進展的關(guān)鍵指標(biāo)，系統(tǒng)性地分析其與關(guān)節(jié)炎的關(guān)聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院2017年3月至2018年3月收治的130例KOA患者作為觀察組，其中男52例，女性78例，年齡45～78歲，平均(54.4±9.2)歲，病程(6.4±4)年?；颊咴\斷符合2003年中華醫(yī)學(xué)會風(fēng)濕病學(xué)會所推薦的美國風(fēng)濕病學(xué)會1995年診斷標(biāo)準(zhǔn)[3],均排除慢性感染者、肝腎疾病、免疫系統(tǒng)疾病、結(jié)締組織疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病及重要臟器嚴重功能障礙者。130例患者分成3組：早期KOA 56例，中期42例，晚期32例。臨床分期嚴格根據(jù)中國中西醫(yī)結(jié)合研究會風(fēng)濕類疾病專業(yè)委員會(1988年4月，昆明)提出的標(biāo)準(zhǔn)[4]，即早期：受累關(guān)節(jié)腫脹以及活動受限，但X線僅提示存在骨質(zhì)疏松和軟組織腫脹；中期：受累關(guān)節(jié)活動明顯受限制，X線顯示不同程度的骨腐蝕以及關(guān)節(jié)間隙變窄；晚期：受累關(guān)節(jié)活動困難，出現(xiàn)畸形、強直、X線顯示關(guān)節(jié)骨質(zhì)嚴重破壞，脫位或融合。同期選擇來我院進行體檢者50例作為對照組，無KOA病史，膝關(guān)節(jié)影像學(xué)檢查正常，與入選的KOA患者從性別、年齡上分析,一般資料比較無差異,具有可比性。

所有患者及家屬對此檢測化驗均知情同意，對膝關(guān)節(jié)正常人群的檢測化驗也進行相關(guān)說明獲得知情同意，且得到醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 樣本采集與保存方法

(1)膝關(guān)節(jié)液：患者采取仰臥位，護士采用常規(guī)方法局部消毒，用2%的利多卡因2～3 mL進行局部麻醉，從股四頭肌外側(cè)緣與髕骨上緣連線交匯處作為穿刺點，進入關(guān)節(jié)腔后，抽取關(guān)節(jié)液1～3 mL(正常對照組抽取0.5 mL)，注入含有肝素的試管內(nèi)，于4 ℃條件下3 500 r/min離心10 min，取上清液，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?2)血液:囑病人空腹，早上8點采集肘靜脈血2 mL，在4 ℃條件下2 500 r/min離心10 min，取上清液，至于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 檢測指標(biāo)及方法

ELISA法測定膝關(guān)節(jié)液及血清中IL-1和TNF-α。所用的試劑盒購買自武漢博士德生物工程有限公司，相對應(yīng)實驗步驟嚴格遵照試劑盒說明進行。采用雙抗體夾心ELISA法，在微孔反應(yīng)板上分別包被抗人IL-1單克隆抗體和抗人TNF-α單克隆抗體，加入待測標(biāo)本，經(jīng)過溫浴使抗原抗體結(jié)合，洗去無關(guān)游離成分，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的特異性抗體，與在單克隆抗體上的人IL-1和TNF-α結(jié)合形成免疫復(fù)合物，洗去未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。加入顯色劑，若反應(yīng)孔中有IL-1和TNF-α?xí)刮迳娘@色劑呈現(xiàn)藍色，加終止液變黃色。在波長為450 nm處測OD值，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中IL-1和TNF-α的濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 兩組膝關(guān)節(jié)液及血清中IL-1和TNF-α含量

經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析，KOA患者膝關(guān)節(jié)液和血清中的IL-1和TNF-α明顯高于對照組(P<0.01)；在疾病的早、中、晚期，IL-1和TNF-α含量均呈上升趨勢，組間兩兩比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見表1)。

表1 各組膝關(guān)節(jié)液和血清IL-1、TNF-α水平檢測結(jié)果 (pg/mL)

2.2 KOA患者膝關(guān)節(jié)液和血清中IL-1和TNF-α水平相關(guān)性分析

膝骨性關(guān)節(jié)炎嚴重程度與膝關(guān)節(jié)液中IL-1和TNF-α水平存在線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r分別為0.726、0.795(P<0.05)。膝骨性關(guān)節(jié)炎嚴重程度也與血清中IL-1和TNF-α水平存在線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r分別為0.709、0.818(P<0.05，見表2)。同時，我們對KOA患者膝關(guān)節(jié)液和血清中IL-1和TNF-α分別進行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)IL-1與TNF-α存在正相關(guān)。見圖1。

表2 KOA患者膝關(guān)節(jié)液和血清中IL-1和TNF-α水平相關(guān)性分析

圖1 KOA患者膝關(guān)節(jié)液和血清中IL-1和TNF-α水平相關(guān)性分析

3 討 論

骨關(guān)節(jié)疾病中以骨性關(guān)節(jié)病最為常見，是一種致殘率較高的慢性退行性疾病，主要累及膝關(guān)節(jié)，髖關(guān)節(jié)，腰部等承重部位，其中，膝關(guān)節(jié)炎占全身骨性關(guān)節(jié)炎的31%。KOA的致病因素多樣，如年齡、遺傳因素、肥胖、不合理的運動方式、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病及其它器官臟器障礙等[5]。KOA患者普遍存在滑膜炎癥狀，細胞因子是參與炎癥進程的重要介質(zhì)之一，IL-1、IL-6和TNF-α等炎性因子均參與其中。IL-1主要是由活化的單核巨噬細胞合成與分泌，是典型的致炎細胞因子。文獻報道,人的病變關(guān)節(jié)可以促進IL-1的產(chǎn)生[6]。IL-1可以通過刺激滑膜細胞產(chǎn)生膠原酶和酪蛋白酶，進而刺激軟骨細胞產(chǎn)生間質(zhì)金屬蛋白酶(MMP),抑制金屬蛋白酶的組織抑制劑的產(chǎn)生，加速軟骨基質(zhì)分解代謝。IL-1還可通過介導(dǎo)人軟骨細胞中的IL-6從而抑制蛋白聚糖(PG)的合成，并可通過內(nèi)源性NO介導(dǎo)抑制蛋白聚糖的合成以及軟骨細胞的生成[7]。IL-1可作為評價臭氧聯(lián)合關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射玻璃酸鈉對膝骨性關(guān)節(jié)炎治療效果及患者預(yù)后的參考指標(biāo)[8]。文獻報道，用IL-1受體拮抗劑(IL-1 Ra)或hIL-1Ra基因轉(zhuǎn)入兔或者狗的膝關(guān)節(jié)內(nèi)，可有效減輕關(guān)節(jié)軟骨的損傷，證明IL-1在KOA的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。

TNF-α來源于成纖維母細胞，巨噬細胞以及軟骨細胞。其主要作用，一方面可促進成纖維細胞釋放出黏附因子，接下來激活并增強血管上皮對黏附因子的表達，使得血液中白細胞與黏附分子二者結(jié)合后相互發(fā)生作用，從而參與對關(guān)節(jié)軟骨的破壞。也可通過刺激滑膜細胞的前列腺素E2產(chǎn)生，加速對骨和軟骨的侵蝕和破壞。另一方面還可刺激人軟骨細胞分泌纖維蛋白溶酶激活劑，使纖維蛋白溶酶原變成纖維蛋白溶酶從而加重關(guān)節(jié)損傷，增加糖蛋白降解，提高磷酸化水平，并且產(chǎn)生膠原酶和其它中性蛋白酶，釋放骨鈣等，從而導(dǎo)致骨和關(guān)節(jié)軟骨的破壞[9-10]。同樣有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α直接參與了膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎疾病的發(fā)生[11]。TNF-α作為炎癥反應(yīng)的樞紐，可誘導(dǎo)協(xié)同IL-1加速疾病的進程。本研究發(fā)現(xiàn)KOA患者關(guān)節(jié)液與血清中IL-1和INF-a二者本身也存在正相關(guān)。葛滿意等[12]在關(guān)節(jié)鏡結(jié)合腓骨截骨治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的療效觀察中發(fā)現(xiàn)，術(shù)后患者TNF-α水平與較術(shù)前均明顯降低。耿洋等[13]在探討關(guān)節(jié)鏡清理術(shù)聯(lián)合電針治療膝骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)的臨床療效中發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)鏡清理術(shù)聯(lián)合電針主要通過降低IL-1和TNF-α水平減少膝關(guān)節(jié)軟骨的破壞，也為本實驗結(jié)果提供了相關(guān)依據(jù)。

IL-1是目前公認的最重要的炎癥細胞因子之一。在關(guān)節(jié)部位，IL-1可刺激TNF-α等細胞因子的分泌[13]。本研究結(jié)果表明膝骨性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液及血清中的IL-1和TNF-α均顯著高于對照組。與之前Chen YJ等人的研究結(jié)果相一致[14]。隨著骨性關(guān)節(jié)炎病程的進展，二者水平也相應(yīng)隨之升高，呈正相關(guān)，說明利用關(guān)節(jié)液與血清中的IL-1和INF-a可間接反映KOA的疾病嚴重程度，而且二者之間可能存在互相調(diào)控的關(guān)系?？傊?，KOA患者IL-1和INF-a的高表達，可能是骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病的重要機制之一。