張秀群 麥富巨 徐丹芬 趙卓姝 賴慧華 溫倩敏

胎兒超聲結(jié)構(gòu)異常篩查多在妊娠11～13+6周進(jìn)行，臨床上常見合并染色體異常的胎兒超聲異常種類包括胎兒心臟結(jié)構(gòu)畸形、胎兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)畸形、胎兒泌尿生殖系統(tǒng)畸形、胎兒骨骼系統(tǒng)畸形、胎兒羊水量異常及胎兒軟指標(biāo)異常等；臨床研究發(fā)現(xiàn)，有0.6%～1.9%的結(jié)構(gòu)異常胎兒存在心臟結(jié)構(gòu)異常，心臟畸形是導(dǎo)致新生兒死亡的重要因素之一，屬于人類先天性缺陷的首位；而經(jīng)胎兒超聲診斷為先天性心臟病的患兒中，染色體異常率高達(dá)40%以上[1]。為深入分析超聲結(jié)構(gòu)異常胎兒的病理特征，提升其臨床診斷價(jià)值，本研究利用染色體核型分析法與CNV 檢測(cè)進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，就此展開針對(duì)性研究，并取得較為理想的臨床研究?jī)r(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本院于2019 年1-12 月收治的137 例超聲檢測(cè)顯示胎兒結(jié)構(gòu)異常的孕婦為觀察對(duì)象，孕婦年齡19～41 歲，平均（29.85±5.36）歲；孕周13～21 周，平均（20.49±3.72）周。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合超聲診斷標(biāo)準(zhǔn)，超聲異常胎兒存在明顯的NT 增厚，無雙胎妊娠，孕婦均無妊娠異常。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：存在先天性疾??；存在認(rèn)知、行為異常；存在表達(dá)能力障礙；存在婦科腫瘤、婦科炎癥。通過染色體核型分析與CNV 檢測(cè)展開聯(lián)合診斷。孕婦或家屬均對(duì)本次研究?jī)?nèi)容知情同意，并簽署知情同意書，且該研究已經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法 （1）本次研究選擇的儀器為Illumina 公司的NextSeq-CN500 測(cè)序儀，試劑為貝瑞和康血漿游離DNA 提取試劑盒（磁珠法），測(cè)序反應(yīng)通用試劑盒，胎兒染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒（可逆末端終止測(cè)序法），美國(guó)THERMO CO2培養(yǎng)箱，北昂LABB M9 全自動(dòng)染色體掃描儀及分析系統(tǒng)、美國(guó)CHANG Amnio 羊水細(xì)胞培養(yǎng)基，以色列 BIOAMF-2羊水細(xì)胞培養(yǎng)基。（2）CNV-seq 檢測(cè)：經(jīng)知情同意后，在超聲診斷儀的引導(dǎo)下，行羊膜腔穿刺術(shù)，抽取羊水20 mL，收集的標(biāo)本送湖南家輝遺傳病醫(yī)院進(jìn)行檢測(cè)，使用北京貝瑞和康公司的科諾安試劑盒，按照標(biāo)準(zhǔn)流程操作進(jìn)行DNA 提取→酶反應(yīng)→純化→文庫(kù)純化→文庫(kù)質(zhì)控→測(cè)序→生物信息分析。結(jié)果判讀參照人類基因組hg19 版本和DGV、DECIPHER、OMIM、UCSCS 及PubMed 等數(shù)據(jù)庫(kù)。結(jié)果判定根據(jù)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)分為：良性CNVs，臨床意義不明確的CNVs（VOUS）和致病性 CNVs。對(duì)檢測(cè)到亞顯微結(jié)構(gòu)異常的致病性CNV 和可能致病的CNVs，建議胎兒父母行CNV-seq 檢測(cè)，以明確變異的遺傳性質(zhì)及相關(guān)臨床意義。（3）染色體核型分析：經(jīng)知情同意后，在超聲診斷儀的引導(dǎo)下，行羊膜腔穿刺術(shù)，抽取羊水20 mL，按照本室常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、染色體制備、G 顯帶及核型分析，必要時(shí)加做C 顯帶。每例計(jì)數(shù)30 個(gè)分裂相，分析6 個(gè)核型，嵌合體時(shí)計(jì)數(shù)50～100 個(gè)細(xì)胞，根據(jù)人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行核型分析診斷。

1.3 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn) 觀察染色體核型分析聯(lián)合CNV 檢測(cè)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)診斷符合率，并分析染色體核型分析的核型結(jié)果與CNV-seq 結(jié)果。（1）染色體核型分析判定標(biāo)準(zhǔn)：染色體核型分析以中期染色體為基礎(chǔ)，根據(jù)染色體的長(zhǎng)度、著絲粒的位置、長(zhǎng)臂和短臂的長(zhǎng)度以及衛(wèi)星的存在與否對(duì)染色體進(jìn)行分析、比較、排序和編號(hào)；如發(fā)現(xiàn)染色體存在數(shù)目畸變（非整倍體、多倍體）或結(jié)構(gòu)畸變（缺失、重復(fù)、易位、倒位、環(huán)狀染色體和等臂染色體等）的情況為異常（陽性）；沒有以上所述的數(shù)目畸變或結(jié)構(gòu)畸變?yōu)檎＃幮裕?。?）CNV 檢測(cè)：檢測(cè)片段長(zhǎng)度大于100 kb 的拷貝數(shù)復(fù)制、缺失情況，參照國(guó)際基因組CNV 多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)Decipher、UCSC Genome Browser、Online Mendelian Inheritance in Man （OMIM）、International Standards for Cytogenomic Arrays（ISCA）等以及相關(guān)文獻(xiàn)評(píng)估CNV 是否致病。①得到CNV 的結(jié)果，與序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，能比對(duì)到數(shù)據(jù)庫(kù)中，人群分別頻率n≥1%，說明CNV為人群中比較常見多態(tài)性即非致病性CNV。對(duì)于沒有比對(duì)到數(shù)據(jù)庫(kù)中的結(jié)果進(jìn)行下一步。②與基因組變異數(shù)據(jù)庫(kù)（database of genomic variants）比對(duì)，數(shù)據(jù)庫(kù)中出現(xiàn)正常次數(shù)n≥3，表明CNV 為正常多態(tài)性即非致病性CNV。針對(duì)n＜3 的CNV 進(jìn)行下一步。③與已知微缺失微重復(fù)綜合征比對(duì)，能比對(duì)到綜合征的CNV 既致病性CNV。其他進(jìn)行下一步。④進(jìn)一步看CNV 涉及區(qū)域中是否包含重要功能基因，不包含基因或重要功能性基因的即為非致病性CNV；包含重要功能性基因進(jìn)行下一步。⑤在網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)中進(jìn)行搜索，CNV 與疾病案例存在片段相同或包含該片段，且臨床表型相似的CNV 即致病性CNV；假如沒有重疊區(qū)域或有重疊但表型不一致，即為不明臨床意義CNV。（3）聯(lián)合檢測(cè)判定標(biāo)準(zhǔn)：染色體核型分析與CNV 檢測(cè)任一結(jié)果顯示陽性即判定為異常（陽性）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各種檢測(cè)方式的異常檢出率比較 本次研究發(fā)現(xiàn)，在137 例經(jīng)超聲檢測(cè)顯示胎兒結(jié)構(gòu)異常的孕婦中，染色體核型分析對(duì)異常胎兒的檢出率低于CNV檢測(cè)以及聯(lián)合檢測(cè)。聯(lián)合檢測(cè)與染色體核型分析的檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CNV檢測(cè)與染色體核型分析及聯(lián)合檢測(cè)的檢出率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各種檢測(cè)方式的異常檢出率比較

2.2 胎兒染色體核型正常而CNV-seq 異常的結(jié)果 染色體核型結(jié)果顯示正常的胎兒中，檢測(cè)出有15 例CNV-seq 結(jié)果為異常，檢出率為10.95%（15/137），其中已知致病性的CNVs 有8 例，其余7 例為VOUS。8 例致病性的CNVs 中，有4 例的CNV 均為16 號(hào)染色體短臂微缺失，其中3 例是16p11.2 微缺失，1 例缺失是16p12.2；2 例為X 染色體短臂微重復(fù)；1 例為19 號(hào)染色體短臂微缺失；1 例為X 染色體單體。7 例CNV-seq 結(jié)果為VOUS 的胎兒中，有3 例為22 號(hào)染色體長(zhǎng)臂微缺失，1 例為22 染色體長(zhǎng)臂微重復(fù)；1 例為9 號(hào)染色體短臂微重復(fù)；1 例為14 號(hào)染色體長(zhǎng)臂微重復(fù)；1 例為15 號(hào)染色體長(zhǎng)臂微缺失。見表2、3。

表2 染色體核型正常的8例致病性CNVs的B超情況與CNV-seq結(jié)果

表3 染色體核型正常的7例VOUS的B超情況與CNV-seq結(jié)果

3 討論

臨床研究統(tǒng)計(jì)我國(guó)新生兒出生畸形率約為3%，由此可見，我國(guó)具有較高的新生兒畸形率，因此開展妊娠期胎兒診斷在提升人口素質(zhì)，降低新生兒畸形率、緩解社會(huì)負(fù)擔(dān)方面具有十分重要的意義[2]。

隨著臨床超聲儀器及檢查技術(shù)的高速發(fā)展，針對(duì)早期胚胎的檢出水平得到明顯提升；通過超聲系統(tǒng)篩查能夠有效檢出胎兒形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，同時(shí)還能夠經(jīng)由超聲軟指標(biāo)觀察胎兒身體狀態(tài)。微小異常指超聲下發(fā)現(xiàn)的胎兒解剖結(jié)構(gòu)非特異微小變化，多屬于正常變異，即軟指標(biāo)；與結(jié)構(gòu)畸形相比，軟指標(biāo)預(yù)后良好，單獨(dú)或同時(shí)出現(xiàn)多個(gè)微小異常在高危妊娠可能增加染色體畸形的風(fēng)險(xiǎn)，且多數(shù)微小異常隨孕周增加而逐漸好轉(zhuǎn)或消失[4]。胎兒超聲結(jié)構(gòu)異常多見于頸項(xiàng)透明層增厚，即NT 增厚，通常在妊娠11～13+6周時(shí)，胎兒頸背部會(huì)出現(xiàn)一層無回聲帶，為皮下組織內(nèi)液體的積聚，在孕11 周時(shí)超過1.9 mm、孕12 周時(shí)超過2.1 mm、孕13 周時(shí)超過2.2 mm、孕11～13+6周時(shí)超過2.5 mm 均可判定為異常情況。針對(duì)NT 增厚與染色體異常，臨床研究發(fā)現(xiàn)在孕早期所有的染色體異常均與NT 增厚有關(guān)，頸項(xiàng)透明層增厚越明顯，發(fā)生胎兒結(jié)構(gòu)異常與染色體異常的概率越大，同時(shí)NT 增厚與胎兒先天性心臟病高度相關(guān)。因此超聲診斷能夠通過檢查心臟位置異常、心房和心室的結(jié)構(gòu)異常、大血管的發(fā)育異常確定胎兒結(jié)構(gòu)異常情況；同時(shí)通過判斷間隔、房室瓣主動(dòng)脈的發(fā)育結(jié)構(gòu)，確定其畸形情況[3]。結(jié)合上述內(nèi)容可知，胎兒的NT 超聲檢查在孕早期對(duì)不同發(fā)育異常情況均有一定的診斷價(jià)值，檢出率超過1/3[4]。

染色體核型分析作為一種經(jīng)典遺傳學(xué)檢測(cè)方式，指將待測(cè)細(xì)胞的染色體依照該生物固有的染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，按照一定的規(guī)定，人為的對(duì)其進(jìn)行配對(duì)、編號(hào)和分組，并進(jìn)行形態(tài)分析的過程[5]。經(jīng)血培養(yǎng)、制片、烤片、染色、掃片、閱片、審核及復(fù)審等過程，能夠有效檢出胎兒結(jié)構(gòu)異常情況，且具有較高的準(zhǔn)確率[6-7]。但其操作流程較為復(fù)雜、分辨率較低，對(duì)于醫(yī)師的技術(shù)要求高，在檢測(cè)中細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及顯帶水平均是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的主要因素。雖然在分子遺傳學(xué)技術(shù)發(fā)展下，熒光原位雜交技術(shù)、熒光定量PCR 技術(shù)得到普及應(yīng)用，但與染色體核型分析一樣存在缺陷，即在檢測(cè)來源未知染色體片段與染色體微缺失微重復(fù)鑒別時(shí)無法準(zhǔn)確識(shí)別[8-9]。近年來，臨床醫(yī)療水平不斷提升，高通量測(cè)序技術(shù)高速發(fā)展，進(jìn)一步推動(dòng)了分子技術(shù)在遺傳病檢測(cè)、腫瘤檢測(cè)、產(chǎn)前篩查、微生物病原體等方面的積極應(yīng)用[10]；而CNV-seq 作為一種以高通量測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方式，在檢測(cè)中不需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，且對(duì)于探針種類選擇、通量等無限制，具備通量高、成本低、操作簡(jiǎn)單、范圍廣泛的優(yōu)勢(shì)[11]。尤其在2019 年4 月所發(fā)布的《低深度全基因組測(cè)序技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用專家共識(shí)》中指出，通過CNV-seq 檢測(cè)有助于對(duì)染色體核型分析中存在的不足進(jìn)行彌補(bǔ)，因此可用于一線產(chǎn)前診斷[12-14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，通過染色體核型分析與CNV 檢測(cè)，能夠有效檢出胎兒結(jié)構(gòu)異常，辨識(shí)胎兒神經(jīng)畸形狀況，便于區(qū)分高危妊娠增加染色體畸形的風(fēng)險(xiǎn)，提示胎兒染色體及心血管方面的異常情況，以便于臨床上及時(shí)采取有效的治療措施[15-16]。染色體核型分析在137 例經(jīng)超聲檢測(cè)結(jié)構(gòu)異常胎兒中的異常檢出率較CNV 檢測(cè)與聯(lián)合檢測(cè)異常檢出率更低，且CNV 檢測(cè)胎兒異常檢出率低于聯(lián)合檢測(cè)異常檢出率。分析原因可知，G 顯帶染色體核型分析方式雖然能夠?qū)φ兹旧w數(shù)目與明顯結(jié)構(gòu)異常情況快速檢出，但受制于分辨率較低的因素影響，對(duì)于片段長(zhǎng)度在5 Mb 以下的結(jié)構(gòu)異常情況難以準(zhǔn)確檢出[11，17]。而聯(lián)合CNV-seq 則能克服現(xiàn)有染色體診斷技術(shù)中存在的缺陷，充分發(fā)揮協(xié)同作用，可以快速、準(zhǔn)確檢測(cè)出＞100 kb 以上的結(jié)構(gòu)異常片段，對(duì)于染色體微缺失或微重復(fù)診斷效果理想[18]；因此染色體核型分析結(jié)合CNV-seq 檢測(cè)的應(yīng)用有助于為臨床診斷提供更詳細(xì)、準(zhǔn)確信息，繼而為遺傳咨詢及生育指導(dǎo)提供可靠依據(jù)。

綜上所述，染色體核型分析與CNV 檢測(cè)在超聲結(jié)構(gòu)異常胎兒中具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，高危妊娠孕婦可通過染色體核型分析聯(lián)合CNV 檢測(cè)盡早篩查胎兒結(jié)構(gòu)異常情況，從而提升臨床控制效果，提升診斷準(zhǔn)確率。